地衣素(Lichenysin)是一种脂肽类的生物表面活性剂,在石油开采、洗涤品、环境修复、农业等领域具有广阔的应用前景。然而,其生产成本高、产量低,限制了地衣素的大规模工业化生产及商业化应用。枯草芽胞杆菌CodY转录因子在富含氨基酸的条件下会阻遏支链氨基酸的合成,而支链氨基酸是地衣素生物合成的前体氨基酸,CodY可能影响地衣素的合成。本文研究了前体氨基酸的添加对出发菌株Bacilluslicheniformis WX02-Psrflch 发酵地衣素的影响,对出发菌株 WX02-Psrflch 进行定向改造得到高产地衣素的工程菌株,探索了cod 基因缺失对地衣素生物合成的影响。通过检测出发菌株WX02-Psrflch地衣素发酵过程中游离前体氨基酸的浓度变化发现,地衣素的组成氨基酸天冬氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸的胞内积累量最大值分别只有 0.4mg/L、6.0mg/L、0.3mg/L、0.3mg/L、1.6mg/L。然而,在B.licheniformiwWX02-Psrflch发酵地衣素的培养基中添加前体氨基酸(包括Val、lle、Leu、Asp和Glu)后,地衣素的产量反而出现不同程度的下降。CodY蛋白与地衣素生物合成的前体氨基酸之间有密切关系,为了明确这种关系,本研究以B.lichheniformis WX02-Psrflch为出发菌株,构建了一系列codY表达差异菌株:codY缺失菌株(WX02-PsrflchAcodY)及不同强度的游离表达菌株(WX02-Psrflch/pHY-P43codY、WX02-Psrflch/pHY-PsrfcodY)。以cod 缺失菌株为研究对象,优化了地衣素发酵的前体氨基酸添加策略,外源添加0.5 g/L混合氨基酸的效果最佳,地衣素产量比出发菌株提高了 25.7%,而codY强化表达菌株的地衣素产量显著下降。对比出发菌株和codY缺失菌株的地衣素分批发酵数据得出,codY缺失菌株的地衣素产量比出发菌株提高了 31.0%,发酵周期由36 h缩短至24 h。codY缺失菌株地衣素发酵的主要溢流代谢产物乙酸、乙偶姻及2,3-丁二醇的含量分别比出发菌株下降了 50.9%、41.4%和25.9%。胞内游离前体氨基酸的检测结果显示,在地衣素的快速合成时期6-12 h,除了两个菌株的Asp浓度基本一致,其余前体氨基酸(包括Val、Leu、lle、Gln)在codY缺失菌株的胞内积累量都高于出发菌株。表明codY缺失后减少了溢流代谢产物的合成,提高了胞内Gln、lle、Leu及Val的浓度。本研究进一步探讨了cod 缺失对地衣素合成途径及调控网络中关键基因表达的影响,qRT-PCR结果表明:codY缺失后,支链氨基酸合成相关的ilvA、ilvB、leuA、bcd及alsS基因的表达量都有不同程度的提高,Gln和Glu合成相关的gln1、rocG的表达量表现为上调,而参与Asp合成的aspB基因的表达量基本不变;地衣素合成基因lchAA以及地衣素合成相关的正调控因子comA和degU的表达量也表现为上调;参与主要溢流代谢产物乙酸、乙偶姻合成的关键基因ackA和alsD的表达量下降。以上结果表明,在B.licheniformiwWX02-Psrflch中,cotdY基因的敲除可以减弱地衣素发酵过程中的溢流代谢途径,增强谷氨酰胺及支链氨基酸的生物合成及其关键基因的表达,同时能促进双组分调控蛋白ComQXPA及DegS-DegU的表达,进而提高地衣素的产量。本文首次探索了cod 基因缺失对地衣素生物合成的影响,并为地衣素的生产提供了科学指导和技术应用。