【摘 要】
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食物过敏是公众广泛关注的食品安全问题,其中水产品是主要致敏食物之一。牡蛎营养价值高,是我国重要的经济水产品,随着牡蛎及其副产品消费量的增加,由其引发的过敏问题也日益增加。迄今为止,牡蛎中致敏原的研究较为欠缺,制约了对牡蛎过敏性疾病的认识。本研究以福建牡蛎（Crassostrea angulata）为对象,鉴定并克隆表达重要致敏原,分析其免疫学特性、抗原表位和交叉反应性,为牡蛎过敏的诊断及预防提供理
【基金项目】
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国家重点研发计划2019YD0901703； 国家自然科学基金32072336；
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食物过敏是公众广泛关注的食品安全问题,其中水产品是主要致敏食物之一。牡蛎营养价值高,是我国重要的经济水产品,随着牡蛎及其副产品消费量的增加,由其引发的过敏问题也日益增加。迄今为止,牡蛎中致敏原的研究较为欠缺,制约了对牡蛎过敏性疾病的认识。本研究以福建牡蛎（Crassostrea angulata）为对象,鉴定并克隆表达重要致敏原,分析其免疫学特性、抗原表位和交叉反应性,为牡蛎过敏的诊断及预防提供理论基础。本研究从福建牡蛎中纯化得到38 kDa组分,经质谱鉴定为精氨酸激酶（Arginine kinase,AK）,进一步通过血清学分析及嗜碱性粒细胞激活试验确定其为牡蛎中致敏原,并将AK的致敏原信息提交至世界卫生组织/国际免疫学会联合会过敏原命名小组,获得系统命名为Cra a 2。随后克隆AK的序列,得到1050 bp的开放阅读框,编码351个氨基酸,表达获得与天然AK具有相似IgG/IgE结合活性的重组AK。进一步比较天然/重组AK的理化性质,发现二者具有相似的二级结构、疏水性、热稳定性及胃肠液消化特性等。通过化学变性剂破坏AK的空间结构发现其IgE结合活性降低但未完全丧失,说明牡蛎AK同时存在线性表位及构象表位。采用生物信息学预测结合噬菌体淘选,获得AK的模拟线性表位及模拟构象表位。进一步利用合成肽段结合血清学验证了AK的11个线性表位(AA56-73、AA77-92、AA93-107、AA105-118、AA121-133、AA134-146、AA165-176、AA185-200、AA227-238、AA 236-247、AA306-323);其中AA227-238具有较强的IgE结合活性,说明其是重要线性表位。通过突变模拟构象表位中的关键氨基酸,鉴定到IgE结合活性显著降低的4个突变体（L7A、M187A、Q227A、H277A）,进而确认AK的4个构象表位依次为C-AK-1、C-AK-2、C-AK-3、C-AK-4;其中L7A的结合活性降低最明显,提示C-AK-1为重要构象表位。通过兔抗福建牡蛎AK/拟穴青蟹AK多克隆抗体发现了AK在牡蛎、虾、蟹物种间存在交叉反应。进一步利用14名牡蛎AK过敏患者血清进行Dot blot分析,其中7份血清同时与牡蛎、虾、蟹AK呈现阳性反应。抑制性酶联免疫吸附实验表明,虾、蟹AK能显著抑制牡蛎AK与IgE的结合,证实物种间AK交叉反应性的存在。此外,氨基酸序列保守性分析发现AA121-133、AA134-146在AK被鉴定为致敏原的15个物种中是保守的。综上,本研究鉴定福建牡蛎重要致敏原AK,克隆得到其开放阅读框,表达获得与天然AK具有相似性质的重组AK;鉴定到AK的11个IgE线性表位及4个IgE构象表位;证实AK在甲壳类及软体类物种间的交叉反应性,发现保守表位AA121-133、AA134-146。这些结果可望为食品加工或表位删除等方式定向消减牡蛎AK致敏性提供理论基础。
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