前言 外伤或疾病引起的关节软骨损伤在临床上很常见，但软骨组织中不具有血管与神经，其损伤后不易自我修复。对于关节软骨损伤的修复在目前的骨科临床、基础研究中仍是一个重要的课题。许多研究表明，生物活性因子在关节软骨的损伤、修复机制中，起着重要的调节作用。如胰岛素样生长因子(IGF)可刺激软骨细胞分化的表型。表皮生长因子(EGF)具有很强的促有丝分裂和刺激合成代谢的作用。在体内许多细胞表面都表达EGF受体。通过细胞生长因子的调控，在体外可以促进软骨细胞的分裂增殖，这方面国内外对TGF-β、IGF、BMP、bFGF的研究较多。尽管通过这些因子对体外培养的软骨细胞进行作用，促进了软骨细胞的分裂增殖，但机体对软骨细胞作用的内环境是多种因子相互作用、相互调节的结果。局部应用生长因子时，有效成分易被稀释或在机体对软骨细胞作用的内环境中丢失。为了寻找更多的可能促进软骨细胞增殖的细胞因子，我们选择用EGF对体外培养的软骨细胞进行调节。因为目前研究认为，EGF对上皮细胞具有很强的致有丝分裂作用，在软骨细胞表面已发现EGF受体存在。关于EGF的研究，在促进上皮细胞的分裂增殖方面研究较多，在对软骨细胞作用的方面研究较少。关于EGF对体外培养的软骨细胞具体定量的研究，以及EGF与IGF协同作用的研究方面，在国内尚未见到相关报道。本实验试图通过不同剂量的EGF对体外培养软骨细胞的作用，以及通过EGF、IGF的分别作用和协同作用相比较，了解其对软骨细胞存活数目和分裂增殖的影响，进而对EGF在体外培养的软骨细胞中的作用效果进行评价，为关节软骨细胞的修复提供进一步的理论依据。 材料与方法 1．软骨细胞的培养：无菌条件下，片状切取2周龄新西兰白兔关节面软骨（脑骨近端、股骨近、远端及胜骨近端人放人PBS液冲洗 2次，将软骨片切成二．ornm xl．ornm xl．stnm左右小粒。经0．2％11型胶原酶 10Inl，37t条件下振荡消化 3．sh，再用 200目不锈钢滤网过滤，去除杂质，获取细胞。此细胞用PBS液洗＊离心 smim三遍，弃上清，沉淀物接种到含 15％胎牛血清（FCS）的DMEM培养基中，在培养瓶中培养，培养条件为 37tj％CO如原代细胞贴壁后，隔日更换培养基，汇合成单层细胞后，传代培养至2代。 2、软骨细胞的观察及检测：门）倒置显微镜观察细胞形态、生长情况；p）细胞爬片Giemsa染色光镜观察细胞生长情况；门）细胞爬片免疫组织化学方法检测11型胶原表达情况；k）酶联免疫检测仪（Mry）测定了解细胞生长因子对软骨细胞存活数目的影响八5）流式细胞仪检测细胞因子对软骨细胞增殖的影响。 实 验 结 果 1、倒置显微镜下可见软骨细胞接种后呈球形，为悬浮状。在接种后3—4小时即可发现少量细胞贴壁，细胞贴壁后变成扁平形态，呈多形性。之后48－72小时，仍有继续贴壁的细胞，体积变小，细胞多形性更明显，扁平细胞变多，可见细胞核分裂相，一部分成复层生长，少数细胞间有间隙的细胞呈四边形或圆形。当细胞在培养瓶中分裂增殖达到汇合成单层细胞后，核分裂相较少，这时可以传代。 ·2· 2、通过细胞爬片Giemsa染色光镜观察，我们可以更清楚地看 到软骨细胞的形态，多数为小细胞，形态有小梭形J圆形及小多 边形，可以见到核分裂。同时还可以看到许多细胞中含有分泌小 泡。 3、细胞爬片D型胶原免疫组化染色光镜观察，可见在细胞聚 集的地方，细胞的胞浆被染成棕色，细胞相互接触少的地方棕色较 淡，细胞密集生长的地方棕色较深，并且细胞外也可见到棕色。说 明在培养的骨软骨细胞中有D型胶原表达，说明培养的细胞具有 软骨细胞的特征，软骨细胞培养成活。 4、细胞存活数情况（MT］？测定结果卜以酶联免疫检测仪 （rs）测定所得的光密度（OD）值，此值与细胞存活数成正比，即 作为细胞相对数，绘出加不同浓度EGF或（和）IGF后的OD值直 方图，其结果经过统计学处理，分析表明，同时加 EGF与 IGF比单 独加任何一种细胞因子都要好，而其最佳浓度组合为EGF10n才Inl 和IGF50ng／Inl。所以我们认为，同时加 EGF与 IGF，并且浓度组 合为 EGF10ng／tnl和 IGF50ng／Inl时的刺激软骨细胞的增殖能力 最强。 5＼将流式细胞仪测定结果按G／M期和S期的百分数比值， 转换成增殖指数，表示增殖情况。其结果经过统计学处理分析，发 现无论是单独加人EGF或IGF，还是两者联合应用，均可以刺激细 胞增殖瞩＜0．01人说明＊＊F和1＊F均是骨软骨细胞增殖促进剂， 这与M’IT测定结果一致。同时发现，EGF＊GF两者联合应用的促 进细胞增殖作用均强于任何一种细胞因子的单独应用，这也进一 步证实了M’IT测定的结果。 讨 论 在软骨细胞增殖和分化的调节机制中，有许多细胞因子参与。