论文部分内容阅读
研究背景:寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)可经蚊子叮咬传播给人类,大部分人感染后无症状,但严重时可引起新生儿小头畸形和成人格林-巴利综合症。目前尚无针对ZIKV感染特异的疫苗和抗病毒药物。因此,深入研究ZIKV致病机制,探索可能的抗病毒药物靶点至关重要。(1)大量研究表明病毒感染可改变miRNA的表达水平;同时,miRNA可以通过抑制某些靶蛋白的表达激活宿主I型干扰素信号通路发挥抗病毒作用。先前其它实验室的报道显示miR-133a-3P可以显著抑制登革病毒复制。我们在前期研究中也发现,ZIKV感染A549细胞后,miR-133a-3p水平显著升高,但其生物学意义,特别是抗ZIKV复制方面的研究尚未见报道。因此,探究miR-133a-3p对ZIKV复制的影响及其作用机制具有重要的价值。(2)干扰素调节因子 2(Interferon regulatory factor 2,IRF2)是Ⅰ型干扰素信号通路的负调控因子,可通过与IRF1竞争干扰素刺激基因ISGs启动子区的ISRE序列和IFNβ启动子区域IRF-E序列,进而抑制IFNβ产生及I型干扰素信号通路,发挥促进病毒复制的作用。此外,有研究显示,IRF2可通过调控FAM111A和RFC3调节病毒复制。然而,IRF2如何调控ZIKV的复制,目前尚不清楚。研究目的:(1)探究miR-133a-3p高表达对ZIKV复制的影响及其可能的作用机制;(2)探究IRF2在ZIKV复制中的作用及机制;(3)阐述miR-133a-3p和IRF2调节ZIKV复制的分子机制。研究内容:(1)研究ZIKV感染对miR-133a-3p表达的影响;(2)研究miR-133a-3p通过Jak/STAT信号通路影响ZIKV复制的机制;(3)证明IRF2是miR-133a-3p的一个靶基因;(4)研究IRF2对I型干扰素信号通路和ZIKV复制的影响及可能的机制。研究方法:(1)ZIKV感染A549细胞,在不同时间点收集细胞,检测miR-133a-3p的表达变化;(2)在A549细胞高表达miR-133a-3p,然后用ZIKV感染。通过RT-qPCR和Western blots检测ZIKV复制情况;(3)在A549细胞中高表达miR-133a-3p,之后感染ZIKV病毒或加入polyI:C 处理,检测 ZIKV RNA 水平及 IFNα,IFNβ,ISG15,IFIT1 mRNA 表达水平;将miR-133a-3p mimic或阴性对照与ISRE-luc报告质粒和pRL-TKreporter质粒共转染至A549细胞,通过双重萤光素酶测定法检测ISRE活性,阐明miR-133a-3p高表达对ZIKV复制及IFN通路的影响;(4)在 A549 细胞转染 miR-133a-3p mimic,通过 RT-qPCR 和 Western blots检测IRF2的表达。miR-133a-3p mimic或阴性对照与pmiR-IRF2-WT或pmiR-IRF2-Mut共转染,通过双重萤光素酶测定法证明IRF2 3’UTR存在miR-133a-3p作用靶位点;(5)在A549、2FTGH和U5A细胞中,敲低IRF2,之后用ZIKV感染细胞,然后加入或不加IFN-β,最后收取总RNA。通过RT-qPCR检测ZIKV的复制和 IRF2、IFNβ、ISG15、IFIT1 mRNA 表达水平,阐明 IRF2 对 ZIKV 复制及IFN通路的影响;(6)在2FTGH和U5 A细胞中,以及IRF2高表达细胞中,分别敲低FAM111A或RFC3,之后感染ZIKV,通过RT-qPCR检测ZIKV的复制情况,明确IRF2是否通过FAM111A或RFC3调控ZIKV的复制。研究结果:(1)ZIKV感染A549细胞引起miR-133a-3p表达显著升高;(2)miR-133a-3p过表达显著抑制ZIKV复制并激活Jak/STAT信号通路;(3)敲低IRF2激活I型干扰素信号通路,但并不抑制ZIKV复制;(4)IRF2可以激活FAM111A表达,从而增强RFC3对ZIKV的宿主限制作用。研究结论:(1)ZIKV感染后,miR-133a-3p表达显著升高;miR-133a-3p高表达可能通过激活I型干扰素信号通路,上调具有抗病毒作用的干扰素刺激基因(ISGs)表达,抑制ZIKV的复制。(2)敲低IRF2激活Jak/STAT信号通路,但在ZIKV复制的调节中不能发挥主导作用,IRF2可能通过促进FAM111A表达进而增强RFC3的宿主限制性作用来抑制ZIKV复制。