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【目的】孤独谱系障碍（Autism spectrum disorder,ASD）,是一组以社会交往障碍和重复刻板行为、兴趣狭窄为核心症状的神经发育性疾病。社交障碍严重限制了患者融于社会的能力,给患者、患者家庭乃至整个社会带来了极大的负担。临床基因测序数据表明SHANK 3（SH3 and multiple ankyrin repeat domains 3）基因突变可导致ASD的发生。动物研究发现,Shank3基因敲除小鼠会出现社会交往障碍及重复理毛等ASD样行为。Shank3基因敲除小鼠已成为目前研究ASD发病机制的代表性动物模型之一。神经元是构成神经系统的基本结构单位。哺乳动物的中枢神经系统（CNS）包含大量的神经元,神经元之间形成复杂的神经网络,从而对外界的刺激产生感知和行使大脑的基本功能。了解孤独症大脑中的形态学变化对我们了解孤独症的发病机制具有重要意义。对Shank3小鼠神经元的形态学研究发现纹状体和前额叶皮质等脑区神经元兴奋性突触数目减少、树突棘密度下降。但是,该孤独症小鼠中特异类型神经元的形态学变化还不够清楚。为了研究不同类型神经元在孤独症动物模型中的形态学改变,我们建立了一种以AAV病毒为载体、基于Cre-loxp系统的新型全脑神经元稀疏标记方法,并用该方法标记Shank3基因敲除孤独症小鼠模型中不同类型的神经元从而分析这些神经元的形态学改变。【方法】1.构建Cre重组酶依赖表达的腺相关病毒质粒p AAV-h Syn-DIO-EGFP-P2A-EGFPf;2.用HEK 293T细胞进行质粒转染,体外检验该质粒是否依赖于Cre重组酶进行表达;3.将病毒质粒p AAV-h Syn-DIO-EGFP-P2A-EGFPf包装成为病毒成品AAVphp.e B-DIO-EGFP-P2A-EGFPf,其中AAVphp.e B血清型具有透过血脑屏障的能力;4.将Shank3鼠与CaMKⅡ-Cre+小鼠,SST-Cre+小鼠交配,通过PCR鉴定得到Shank3敲除Cre+鼠和Shank3野生型的Cre+鼠;5.用病毒AAVphp.e B-DIO-EGFP-P2A-EGFPf对Shank3敲除Cre+小鼠和Shank3野生型的Cre+小鼠进行眼眶后注射;6.注射病毒3周后,采集小鼠脑组织,进行冠状面切片、免疫荧光染色等操作,并利用共聚焦显微镜对不同脑区标记的神经元进行XYZ扫描;7.采用Imaris软件对扫描记录的单个神经元图像进行3D结构重塑,并通过统计分析比较Shank3敲除小鼠（Shank3 KO）和野生型（WT）小鼠神经元形态各项指标的差别。【结果】1.病毒质粒p AAV-h Syn-DIO-EGFP-P2A-EGFPf构建成功,并在体外验证了该载体中的增强型绿色荧光蛋白的表达依赖于Cre重组酶的表达。将载体包装成成品病毒AAVphp.e B-DIO-EGFP-P2A-EGFPf;2.经小鼠眼眶后注射的AAVphp.e B-DIO-EGFP-P2A-EGFPf病毒可以对Cre小鼠进行全脑特异类型神经元稀疏标记;3.与WT小鼠相比,Shank3 KO小鼠纹状体MSN（Medium-sized spiny neuron）树突复杂程度和树突棘总密度降低,树突总长度和总体积没有差异;4.与WT小鼠相比,Shank3 KO小鼠皮质II-III层锥体神经元的树突复杂性和树突棘总密度显著降低,树突总长度和总体积没有差异;5.Shank3 KO小鼠皮质V-VI层锥体细胞基树突比WT小鼠更为复杂,Shank3KO和WT的树突总长度和总体积没有差异;6.与WT小鼠相比,Shank3 KO齿状回锥体神经元的树突复杂性降低,树突总长度、总体积和树突棘总密度没有差异。【结论】1.AAVphp.e B-DIO-EGFP-P2A-EGFPf病毒可以被应用于Cre转基因小鼠大脑特异类型神经元的稀疏标记。2.Shank3 KO小鼠纹状体、皮质、海马齿状回的CaMKⅡα+神经元均表现出不同程度的结构性损伤。MSN、皮质II-III层锥体神经元、齿状回锥体神经元均表现为树突复杂性降低,只有皮质V-VI层锥体细胞基树突的复杂性升高。除了齿状回锥体神经元,其余区域神经元的树突棘总密度均不同程度降低。3.该方法为未来研究ASD以及其他精神障碍和神经系统疾病中发生的特异类型神经元形态变化提供了一种新工具。