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丰加霉素(Toyocamycin,TM)是核苷类抗生素家族中的一员。它在抑制真菌方面表现出很高的活性,在植物病害防治领域具有重要的应用潜力。本论文针对TM生产菌株淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628产量低等问题,克隆了涉及S.diastatochromogenes 1628丰加霉素生物合成的多个功能基因,利用代谢工程手段有效提高了S.diastatochromogenes 1628的丰加霉素的合成水平。首先,以S.diastatochromogenes 1628 DNA为模板,设计简并引物,克隆得到参与TM生物合成大小分别为1443 bp的toy F(编码腺苷酸琥珀酸裂解酶)(Gen Bank登录号:JQ267374)和1284 bp的toy G(编码腺苷琥珀酸合成酶)基因(Gen Bank登录号:KF517415),其分别与已公布的多株链霉菌对应基因的氨基酸序列具有很高的相似性,其中与S.venezuelae ATCC 10712的氨基酸序列同源性最高,分别为90%和95%。将toy F和toy G基因分别置于链霉菌整合型载体p IB139中的Perm E*启动子下游,构建了重组载体p IB139-toy F和p IB139-toy G,通过接合转移法获得重组菌1628-TOYF和1628-TOYG。将原始菌株1628与重组菌1628-TOYF、1628-TOYG进行TM发酵、酶活分析及细胞干重检测。重组菌中的TM产量和相应的酶活TOYF(TOYG)均高于原始菌。其中,重组菌1628-TOYG TM产量增幅最高达26.2%。其次,以S.diastatochromogenes 1628 DNA为模板,设计简并引物,克隆了大小为558bp编码核糖体再循环因子frr基因,其与Streptomyces flavogriseus ATCC 33331、Streptomyces venezuelae ATCC 10712和Streptomyces sp.NRRL F-2580菌株的Frr氨基酸序列同源性最高,分别为92%、92%和89%。在S.diastatochromogenes 1628中过量表达了frr基因,获得重组菌1628-FRR(整合p IB139-frr)。1628-FRR与原始菌株1628发酵性能相比,TM产量增加了41.1%,细胞干重增长了21%,发酵时间从84 h缩短至72 h。通过RT-PCR分析发现,与原始菌株1628相比,重组菌1628-FRR中基因toy F和toy G转录水平均有提高,且基因toy G转录水平增加更为明显。另外,利用基于绿色荧光蛋白(GFP)的荧光强度检测实验发现,frr基因的过量表达能加速蛋白合成,发酵过程中后期此效果尤为显著,从而导致TM产量的提高。最后,将toy G基因分别与frr以及编码透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin)的vgb基因串联,以及三基因串联表达考察对1628菌株合成TM的影响。发酵结果显示,在构建的多株重组菌中,vgb、frr和toy G基因分别置于Perm E*启动子下的三基因串联表达的重组菌1628-VGF,TM产量最高,该菌株发酵72 h时TM产量达到319.2 mg/L,而原始菌株1628发酵84 h时TM产量只有147.1 mg/L,TM的生产强度从提高1.75 mg?L-1?h-1至4.43 mg?L-1?h-1。此文构建的重组菌1628-VGF为丰加霉素规模化生产奠定了良好的基础。