骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cell，BMSC)是造血微环境的重要组成部分，它不仅为造血干细胞的生长提供附着场所，而且还通过与造血干细胞的直接接触和分泌多种生长因子，调节和影响造血干细胞和免疫前体细胞的成熟和分化。因此，从BMSC中寻找新型免疫分子将有助于深入认识BMSC的生物学和免疫学功能，阐明其作用的分子机理，获得参与其功能有关分子的重要信息，从而从分子和基因水平上对二者独特的功能作用机制有更深入和全面的了解。本文所研究的hPEBP4就是通过对人BMSC cDNA文库进行大规模随机测序获得的新分子。 第一部分、hPEBP4的克隆和序列分析、组织细胞分布和细胞定位研究 磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP)蛋白是一类能与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)结合的蛋白。该家族的所有成员都含有与PE结合的保守区域(PBP)。经大规模随机测序和同源比较，我们从人BMSC cDNA文库中分离到一个新EST(C781)，其全长cDNA为874 bp，编码227氨基酸的蛋白。该蛋白在核酸和氨基酸水平上与人磷脂酰乙醇胺结合蛋白高度同源，含有PBP保守区域。根据该家族的命名法和当时已经报道的PEBP家族序列，该全长新基因被命名为hPEBP4。hPEBP4序列已经在GenBank／EMBL数据库登录，序列号为AY037148。并申请国家发明专利，国家发明专利申请号为02136524.6。 同源比较和多肽结构分析显示，hPEBP4蛋白在75位到195位为磷脂酰乙醇胺结合保守区域。Pro97，Asp98，Pro100，His112和Arg149为PEBP家族中的保守氨基酸，涉及到决定PEBPs配体结合位点的基本结构。氨基酸残基(91-117)和(141-153)是PEBP4s亚家族中两个主要的高度保守区。氨基酸残基91-101(包括cis Pro100)组成结合区的边缘。而96-98和100残基形成的Asp-Pro-Asp-x-Pro基序为PEBP家族所有成员都含有的保守序列。Asp96和His112存在于结合口袋的底部。浙江大学.博士学位论文上篇.中文摘要146一149残基和Gly一x一His.Arg残基组成第二个高度保守区域。141一153之间的保守区域形成结合口袋另一边。hPEBP4的这些结构特征提示hPEBP4含有PE结合区域。 RT-PCR结果显示hPEBP4在B淋巴瘤NAMALW人和Daudi细胞，前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌细胞中高表达。N。找hem杂交结果显示，hPEBP4 mRNA在正常成人组织中辜丸，心脏，骨骼肌和胸腺高表达，在肺，肝，脑，脊髓，肾上腺，骨髓低表达。在正常脑组织中，我们检测的每一部分(包括杏仁核、尾状核、脐服体、海马及丘脑)均高表达hPEBP4。肺癌A549细胞和结肠腺癌LoVo细胞不表达hPEBP4，经TNFa刺激8小时后开始表达，12小时达到高峰。这提示hPEBP4在对外界刺激应答时发挥一定的作用，可能保护细胞免受不利因素的损害。同时我们构建了hPEBP4完整编码区以及PBP保守区域缺失印75 PEBP4)的C端融合荧光蛋白(GFP)的真核表达载体，并在HEK293细胞中进行了瞬时表达，进行亚细胞定位研究。Confocal显微镜分析结果显示，hPEBP4分子在正常情况下与溶酶体共定位，但经TNFa刺激后转位到细胞膜上。缺失PBP保守区域的p75PEBP4虽然也定位于溶酶体，但TNFa刺激后不转位到膜上，这与文献报道受到外界刺激时，PE结合区域(accession Ps01220)介导PEBPs转位到膜上是一致的。 为了检测hPEBP4在组织细胞中的蛋白表达，我们采用GST融合表达系统，利用原核表达载体pGEX一ZT将hPEBP4与日本血吸虫GST基因以融合形式在E.coli宿主菌中进行了化学诱导性高水平分泌表达。磷脂酞乙醇胺结合保守区域位于hPEBP4的75位到195位，为了提高抗体的特异性，避免所产生抗血清的交叉反应性，我们选择了hPEBP4与同源分子相似性最低的N端1一99个氨基酸的蛋白作为免疫家兔的抗原。所表达的可溶性融合蛋白以谷肤甘肤sePharose 4B进行了亲和层析纯化。纯化得到的融合蛋白保持了原有的抗原性，免疫家兔获得了多克隆抗血清。免疫血清以饱和硫酸馁沉淀及A蛋白亲和层析进行了纯化。经W匕ste爪印迹分析证明该免疫血清具有较好的免疫学活性和抗原优先性。利用该抗体，我们检测了hPEBP4在人类正常乳腺组织和乳腺癌组织的表达。结果提示hPEBP4在乳腺癌组织高表达，而在正常组织不表达。同时Rl’- PCR也证实了同样的结果。第二部分、hPEBP4的生物学功能研究及机制探讨浙江大学·博士学位论文上篇·中文摘要 在第一部分研究中，我们发现TNFa能诱导hPEBP4在A549细胞和LoVo细胞中表达的上调，以及从溶酶体到细胞膜的转位，因此，我们选择TNFa敏感的L929细胞，研究hPEBP4的生物学功能。hPEBP4在L929细胞中的过表达能抑制TNFa刺激和Ras过表达所引起的MEKI和ERK的活化，但不影响Raf-1活化。免疫共沉淀及体外结合试验证实了hPEBP4能与Raf-1和MEKI相互作用。共聚焦显微镜进一步证实，在TNFa刺激下，hPEBP4离开溶酶体，转位到细胞膜上，与raf-l或者MEKI发生共定位，而PBP保守区域缺失的突变体p75PEBP4，对MEKI和ERK活化没有作用，也不能与raf-1和MEK相互作用。P75PEBP4和hPEBP4都定位于溶酶体，但侧Fa