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目的:观察微小RNA(micro RNA,miR)-122-5p和155-5p在转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1诱导心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖和分化中的作用,同时观察芹菜素对其的影响,并在小鼠心肌纤维化模型上进一步加以证实,以阐明miR-122-5p和155-5p与TGF-β1/Smads之间的关系,以及芹菜素影响CFs活化和改善心肌纤维化的作用机制,为芹菜素应用于防治心肌纤维化提供充分的药理学依据。方法:(1)在体外,采用TGF-β1刺激的CFs,观察不同浓度的芹菜素对CFs表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、collagenⅠ、collagenⅢ、缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)-1α、细胞内凯特-斯隆基因(cellular Sloan-Kettering Institute,c-Ski)、Smad2/3/4/7和p-Smad2/3的影响;同时也观察芹菜素对细胞中miR-146a-5p、miR-21-5p、miR-133-5p、miR-27b-5p、miR-122-5p和miR-155-5p表达的影响,以选择合适的芹菜素浓度和确定受其影响的miR。(2)将转染miR-122-5p mimic或inhibitor的CFs联合TGF-β1刺激,并同时给予芹菜素处理,观察miR-122-5p、α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、HIF-1α、Smad2/3/7和p-Smad2/3表达的变化,以探究miR-122-5p在TGF-β1诱导CFs表型转化和胶原合成中的作用,以及芹菜素对其的影响。另将miR-122-5p mimic与LV-HIF-1α共转染CFs,观察miR-122-5p对HIF-1α、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4和Smad7表达的影响,采用生物信息学方法预测miR-122-5p与HIF-1α之间的相互作用关系,并用荧光素酶实验确定它们的靶向结合。(3)将转染miR-155-5p mimic或inhibitor的CFs联合TGF-β1刺激,并同时给予芹菜素处理,观察miR-155-5p、α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、c-Ski、Smad2/3/7和p-Smad2/3表达的变化,以探究miR-155-5p在TGF-β1诱导CFs表型转化和胶原合成中的作用,以及芹菜素对其的作用。采用生物信息学的方法来预测miR-155-5p的作用靶基因,并进一步采用荧光素酶实验确定miR-155-5p与其靶基因的结合。(4)在体内实验中,将ICR雄性小鼠随机分为对照组、模型组、芹菜素75、150和300 mg/kg组、卡托普利25 mg/kg组。给药组于上午按0.2 m L/10 g体重灌胃给药,3 d后与模型组一起,于下午皮下注射异丙肾上腺素5 mg/kg 1次,次日将剂量调整为2.5 mg/kg/d,连续30 d,之后药物处理组再继续给药7 d。实验结束时,小鼠禁食12 h后取眼眶血和心脏,心脏称重后计算心重系数,部分心肌用冷生理盐水制成10%组织匀浆,用比色法测定血清和心肌组织中的丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量,部分心肌固定切片后进行Masson染色,观察胶原纤维沉积的程度,部分心肌置-80°C冰箱,用于检测miR-122-5p、miR-155-5p、α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、TGF-β1、核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)、HIF-1α、c-Ski、Smad2/3/4/7和p-Smad2/3 m RNA或蛋白表达。结果:(1)在TGF-β1刺激的CFs中,加入芹菜素6-24μM后,可剂量依赖性降低α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、HIF-1α、Smad2/3和p-Smad2/3的m RNA或蛋白表达(p<0.05或p<0.01),增加c-Ski和Smad7的m RNA和蛋白表达(p<0.05或p<0.01)。芹菜素6-24μM也可剂量依赖性逆转TGF-β1对CFs中miR-122-5p和miR-155-5p表达的影响。(2)CFs转染miR-122-5p mimic后,细胞中miR-122-5p和Smad7 m RNA或蛋白表达显著增加(p<0.01),而α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、HIF-1α、Smad2/3和p-Smad2/3m RNA或蛋白表达显著降低(p<0.05或p<0.01)。CFs转染miR-122-5p inhibitor后,则出现相反的结果。用TGF-β1刺激miR-122-5p mimic转染的CFs,TGF-β1诱导CFs分化和胶原合成的效应降低(p<0.05或p<0.01)。MiR-122-5p mimic联合芹菜素后,抑制TGF-β1对CFs活化的作用进一步增强(p<0.01)。用TGF-β1刺激miR-122-5p inhibitor转染的CFs,TGF-β1诱导CFs分化和胶原合成的作用则进一步增强(p<0.05或p<0.01)。芹菜素可拮抗miR-122-5p inhibitor增强TGF-β1活化CFs的效应(p<0.01)。在HIF-1α过表达的CFs中,HIF-1α、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表达显著增加(p<0.01),Smad7表达显著降低(p<0.01)。HIF-1α介导的这些效应能够被miR-122-5p mimic逆转(p<0.05或p<0.01)。荧光素酶实验结果显示,miR-122-5p mimic和HIF-1α3’-UTR野生型质粒共转的荧光素酶活性显著降低(p<0.01),显示HIF-1α是miR-122-5p作用的靶基因。(3)CFs转染miR-155-5p mimic后,细胞中miR-155-5p、α-SMA、collagenⅠ/Ⅲ、Smad2/3和p-Smad2/3的m RNA或蛋白表达显著增加(p<0.01),而c-Ski的m RNA和蛋白表达显著降低(p<0.01)。CFs转染miR-155-5p inhibitor后,则出现相反的结果。用TGF-β1刺激miR-155-5p mimic转染的CFs,TGF-β1诱导CFs分化和胶原合成的效应进一步增强(p<0.05或p<0.01)。芹菜素可拮抗miR-155-5p mimic增强TGF-β1活化CFs的效应(p<0.01)。用TGF-β1刺激miR-155-5p inhibitor转染的CFs,TGF-β1诱导CFs分化和胶原合成的作用则被抑制(p<0.05或p<0.01)。MiR-155-5p inhibitor联合芹菜素后,抑制TGF-β1对CFs活化的作用进一步增强(p<0.05或p<0.01)。荧光素酶实验结果显示,miR-155-5p mimic和c-Ski 3’-UTR野生型质粒共转的荧光素酶活性显著降低(p<0.01),显示c-Ski是miR-155-5p作用的靶基因。(4)在动物实验中,芹菜素组的心重系数、心肌组织中的羟脯氨酸和MDA含量显著降低(p<0.05或p<0.01),心肌组织中的SOD和GSH-PX活力则显著增加(p<0.05或p<0.01)。心肌组织的Masson染色结果显示,芹菜素组的胶原染色面积显著减少(p<0.01)。Real-time PCR和Western blot结果显示,芹菜素可显著增加miR-122-5p、c-Ski和Smad7的表达(p<0.01),抑制miR-155-5p、NF-κB p65、HIF-1α、TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3的表达(p<0.01)。结论:MiR-122-5p和155-5p参与了TGF-β1/Smads信号通路介导的CFs活化,它们的作用靶基因分别为HIF-1α和c-Ski。芹菜素可通过增加miR-122-5p和降低miR-155-5p的表达调节各自的靶基因HIF-1α和c-Ski表达,从而逆转TGF-β1介导的Smad2/3上调和Smad7下调;芹菜素也可通过增加机体的抗氧化能力削弱NF-κB/TGF-β1途径的激活,抑制CFs的活化而发挥抗心肌纤维化作用。