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帕金森氏病(PD)为进行性神经退行性疾病,黑质致密部(SNpc)多巴胺能神经元的丢失是该疾病的特征,一旦发生尚无有效的治疗方法。研究表明某些环境因素暴露与PD的发生有关,但机制尚未完全阐明。因此,阐明影响PD发生的基因-环境交互作用机制对预防和治疗该病至关重要。百草枯(PQ,1,1’-二甲基-4,4’-二联吡啶),一种广泛用于农业的杀虫剂,已证明是PD的主要风险因素。PQ的化学结构与一种化学物MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)相似,后者是构建PD小鼠模型广泛使用的毒物。PQ在中枢神经系统某些部位产生超氧阴离子自由基(O2·),从而引发一系列级联反应,产生过多的活性氧(ROS);过多的ROS可能是造成神经元永久性损伤的元凶。此外,ROS的蓄积破坏细胞内谷胱甘肽(GSH)的稳态和几种抗氧化酶的活性。核因子红细胞-2相关因子(Nrf2),是众多氧化应激反应的关键因子之一,它通过与ARE(抗氧化应答元件)结合来调节下游抗氧化蛋白和解毒酶的表达。在氧化应激下,Nrf2被多种蛋白激酶(MAPKs,PKC和PI3K)磷酸化。随后,磷酸化Nrf2易位到细胞核中以激活靶基因的表达。JWA基因,最初被发现为全反式视黄酸应答因子,通过调节碱基切除修复(BER)途径来修复氧化应激引发的DNA损伤。星形胶质细胞JWA通过抑制NF-κB的活性以及破坏ROS的产生来保护多巴胺能神经元免受MPTP诱导而发生变性。然而,JWA在神经元中是否具有与PQ损伤相似的保护作用仍然未知。本研究中,两个神经元细胞系(HT-22和SH-SY5Y)和神经系统JWA基因剔除(JWA-nKO)以及年龄匹配的野生型(JWA-nWT)小鼠分别被用来进行PQ体外和体内试验。结果表明JWA可通过调节Nrf2保护神经元拮抗PQ造成的细胞DNA损伤和凋亡。方法:对神经系统JWA基因剔除(JWA-nKO)以及年龄匹配的野生型(JWA-nWT)小鼠进行PQ慢性染毒。PQ慢性染毒模型:7 mg/kg PQ腹腔注射,隔天注射,共8次。模型结束后进行小鼠行为学试验,包括转棒试验、爬杆试验和旷场试验。模型结束1周后处死小鼠,提取中脑制备蛋白样品和冰冻切片,检测TH神经元在中脑内的表达。在转染了Flag-JWA,siRNAJWA和对照质粒后的两株神经元细胞系HT-22和SH-SY5Y中,Western blot法,TUNEL染色法和DCFH-DA法检测PQ诱导的DNA损伤相关分子表达、凋亡和氧化应激等指标,试剂盒检测GSH,GPx含量。Western blot法,实时定量PCR检测JWA下游分子Nrf2的表达。通过免疫组化法在JWA-nKO小鼠中脑内检测Nrf2的表达情况。结果:1.神经系统JWA基因剔除(JWA-nKO)小鼠易受百草枯损伤。腹腔注射PQ导致JWA-nKO小鼠从第8天开始,体重出现显著下降,至模型结束时,PQ组JWA-nKO 小 鼠的体重约为试验开始时的 84.80%。转棒实验中,PQ 组 JWA-nKO 小鼠停留在旋转着的滚轴上的时间为116.63±19.18 s,与对照小鼠(218.63±39.84 s)相比显著减少(P<0.05)。爬杆试验中,PQ组JWA-nKO小鼠从杆顶自由爬至平台的时间为34.00±13.18 s,与对照小鼠(17.89±6.84 s)相比显著延长(P<0.05)。此外,尼氏染色显示PQ诱导下,JWA-nKO小鼠SNpc中的神经元数量显著低于JWA-nWT小鼠(P<0.05)。2.神经元细胞系对百草枯刺激更为敏感。CCK-8法检测得出:体细胞293T对PQ 24小时IC50值为3698 μM,而海马神经元细胞HT-22对PQ 24小时IC50值为258μM,48小时IC50值为80μM;人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y对PQ24小时IC50值为450μM,48小时IC50值为 157μM。3.神经元细胞中JWA的表达在PQ诱导后应激性升高。凋亡标志物(Caspase-3和PARP-1剪切体)的表达随着PQ诱导时间的增加而升高,在处理36h后,凋亡相关分子的表达升高至基础水平的3-4倍。在这一过程中,JWA的表达也表现出应激性的上调。DNA损伤标记物(XRCC1,polβ和p53)的表达随着PQ诱导剂量的增加而升高,JWA的表达水平也随之升高。4.JWA拮抗PQ诱导下神经元细胞中发生的DNA损伤。高表达JWA的HT-22和SH-SY5Y细胞在PQ诱导下,细胞存活率更高。免疫荧光结果显示8-OHdG(DNA损伤的标志)的表达与JWA水平负相关。SOD和MDA检测试剂盒的结果显示:PQ诱导下,低表达JWA的神经元细胞内,SOD活性下降,分别为对照细胞的89.32%和92.00%;而MDA水平上升,分别为对照细胞的1.45和1.61倍。5.JWA通过减少活性氧(ROS)蓄积从而拮抗PQ诱导的神经元凋亡。PARP-1和Caspase-3的剪切体表达与JWA水平负相关,并且这一趋势随着PQ诱导的浓度升高而增强。同时,TUNEL阳性细胞数与JWA的表达水平显著负相关。低表达JWA的SH-SY5Y细胞中,TUNEL阳性细胞的数量是对照组的1.36倍,而高表达JWA的神经元细胞中TUNEL阳性细胞数量仅占对照组的69.13%。进一步研究表明,PQ诱导下ROS产生的数量也与HT-22和SH-SY5Y细胞中的JWA水平呈负相关。6.JWA在PQ诱导下促进了细胞内GSH,GPx的含量和Nrf2的转录水平。PQ诱导后,高表达JWA的HT-22和SH-SY5Y细胞中GPx分别升高至对照组的1.60倍和1.13倍,胞内GSH的含量与对照组相比,分别升高1.30倍和1.50倍。PCR分析显示在神经元细胞中下调JWA的表达,Nrf2,GPx和HO-1的转录水平显著降低,而在过表达JWA的神经元细胞中显著升高。7.JWA通过PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路正调控Nrf2的表达。下调神经元细胞中JWA的表达,并用PQ诱导后,p-ERK,p-AKT(Thr308)和Nrf2的表达水平下降。此外,MEK/ERK抑制剂(U0126)或PI3K/AKT抑制剂(LY294002)处理神经元细胞后,PQ诱导下,细胞存活率仅为高表达JWA的神经元细胞的90.20%和81.63%,JWA对Nrf2的表达上调同样被逆转。并且,高表达JWA后升高的SOD,MDA,GSH和GPx活性也在抑制MEK/ERK或PI3K/AKT信号通路后而降低。8.JWA调控小鼠体内神经元TH和Nrf2的表达。与JWA-nWT小鼠相比,PQ诱导后,JWA-nKO小鼠体内的Nrf2表达仅为JWA-nWT小鼠的14.33%,酪氨酸羟化酶TH的表达水平仅为JWA-nWT小鼠的21.96%;然而,用生理盐水处理的小鼠中,以上二者没有显著差异。并且,免疫组织化学试验证实,PQ诱导后的JWA-nKO小鼠中脑内Nrf2的水平显著降低。结论:本研究首次证实JWA通过调节MAPK/ERK-Nrf2和PI3K/AKT-Nrf2信号通路拮抗PQ诱导的神经元损伤。JWA是调控PQ致神经元损伤和凋亡的关键分子,可作为预防和治疗PQ致PD的潜在新靶标。