目的:黑色素瘤是一种常见的、恶性度极高的皮肤恶性肿瘤,具有高侵袭性、高死亡率和高免疫原性等特点。临床上用于治疗黑色素瘤的易普利姆玛在Ⅱ期临床试验中,50%的患者出现了不良反应,部分更因出现严重的胰腺炎而被迫终止用药。纳武单抗也只有在辅助手术切除治疗时才具有较长的无复发生存期。因此找到一种更有效的治疗恶性黑色素瘤的方法刻不容缓。5-azacytidine(Aza)已被FDA批准用于治疗骨髓增生异常综合征,低剂量的Aza能通过去甲基化作用使机体内沉默的ERVs表达出来,从而通过病毒防御途径激活免疫。Toll样受体是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁,Toll样受体7(TLR7)激动剂能够有效激活免疫从而发挥对抗肿瘤的作用。本研究的目的包括:(1)合成新型的TLR7小分子激动剂;(2)探索将此TLR7激动剂与经Aza处理后的黑色素瘤细胞相偶联制备全细胞肿瘤疫苗的方法;(3)验证所制备的肿瘤疫苗于小鼠体内的抗肿瘤效果。方法:(1)用化学方法合成全新的、高纯度的TLR7激动剂SZU-106,并用质谱和核磁共振波普分析进行结构鉴定。(2)用ELISA方法检测SZU-106在体外对免疫细胞的免疫激活效果。(3)用CCK8方法确定Aza对黑色素瘤B16-F10细胞的最佳作用浓度。(4)用ELISA方法检测Aza对黑色素瘤B16-F10细胞的最佳作用浓度。(5)用0.5μM Aza刺激B16-F10细胞后再偶联SZU-106,并用紫外照射方法灭活黑色素瘤细胞,制备成Aza-cell-106全细胞肿瘤疫苗。(6)ELISA验证肿瘤疫苗的体外免疫激活效果。(7)用流式细胞术分析肿瘤疫苗对DC的影响。(8)建立小鼠黑色素瘤模型,验证肿瘤疫苗的抗肿瘤效果。(9)取材进行T细胞浸润分析。(10)CBA验证肿瘤疫苗的体内免疫激活效果。结果:(1)成功合成全新TLR7激动剂SZU-106,SZU-106在体外可激活免疫细胞分泌免疫因子,并由于其特有的羧基结构,能和细胞通过化学方法偶联。低剂量的Aza能通过去甲基化作用使沉默的内源性逆转录病毒(ERVs)表达出来,开启病毒防御通路,使B16-F10细胞内的TLR3高表达。(2)成功制备Aza-cell-106全细胞肿瘤疫苗,此肿瘤疫苗在体外可刺激小鼠脾淋巴细胞和骨髓来源树突状细胞(BMDC)分泌大量免疫因子,促进DC成熟,增强其抗原提呈能力。(3)在小鼠黑色素瘤肿瘤模型中,肿瘤疫苗可引起小鼠体内瞬时免疫因子升高,从而刺激免疫,抑制肿瘤生长,肿瘤体积明显缩小,延长小鼠生存周期,而且实验组小鼠生存状态良好,并无恶液质现象出现。肿瘤疫苗和Repertaxin联合治疗时,能显著增加CD4+T和CD8+T细胞的浸润,明显增强Repertaxin的治疗效果。结论:新合成的SZU-106是有效的TLR7激动剂,新制备的Aza-cell-106全细胞肿瘤疫苗在体内外都有较好的免疫激活效果,可有效抑制小鼠体内肿瘤生长,为黑色素瘤的免疫治疗带来了曙光。