目的:喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,在我国东北部地区高发,且发病率呈逐年上升趋势,已成为危害人民身体健康的重要疾病之一。目前喉癌的治疗是以手术为主辅以放疗和化疗的综合治疗。近年来尽管喉癌在治疗上取得了多方面的进展,但由于缺乏有效的早期诊断标志物,易发生恶性增殖与颈部淋巴结转移,加之缺少特异敏感的药物,喉癌患者的喉功能保存率及五年生存率难以获得实质性的提高。因此,研究喉癌的发病机制,寻找新的治疗靶点,提高喉癌患者的临床疗效,已成为当务之急。MicroRNAs（miRNAs）属于非编码RNA,是由约22个核苷酸构成的小分子RNA。Mi RNAs通过靶向靶分子的3’端非翻译区（untranslated region,UTR）发挥转录后调控的作用。越来越多的研究结果显示miRNAs参与肿瘤的各个过程,包括肿瘤发生、增殖、转移、复发和耐药等。例如,miR-365可通过RAC1途径调控肝癌干细胞。Mi R-383-5p通过靶向HDAC9分子进而抑制胃癌的进展。有研究报道miRNAs存在于各种体液中,结构稳定且可反映起源组织的病理生理状况,这一特点可使它成为新的有前途的生物标志物。多项研究报道了数种在人类喉癌中异常表达的不同miRNAs,包括miR-9、miR-29a-3p、miRNA-221等。miR-552是一种新发现的miRNA,其在生理或病理过程中发挥的作用及作用机制尚未被完全阐明。既往研究表明,miR-552可通过靶向WIF1促进骨肉瘤细胞的增殖和转移。此外,Mi R-552通过抑制AJAP1表达促进肝癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转换（epithelial mesenchymal transition,EMT）。同时还有研究报道miR-552促进肝癌起始细胞的自我更新及化疗耐药。然而,作为重要的节点分子miR-552在喉癌中的生物学作用及调控机制尚不清楚。肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）是一小群具有自我更新能力和致瘤性的癌细胞,已有研究表明肿瘤干细胞是肿瘤形成、生长、转移、复发和介导放疗抵抗和化疗耐药的最主要原因。越来越多的证据表明喉癌中存在肿瘤干细胞,可利用其干性标志蛋白CD133、CD44直接从切除的喉癌组织中分离出来。此外,也可以从原代培养的人喉癌细胞中鉴定出肿瘤干样细胞。因此,研究喉癌干细胞特性有助于阐明喉癌的发展,对于深入了解喉癌的复发转移也具有重要意义。本课题拟检测喉癌组织及细胞中miR-552的表达情况,通过设计包装miR-552的过表达和敲减慢病毒,感染喉癌细胞系建立稳定的过表达和敲减细胞系,通过体内和体外实验研究miR-552对喉癌细胞生长和转移的调控作用;通过流式细胞仪和低粘附培养富集喉癌干细胞,检测分析miR-552在喉癌干细胞中的表达情况,并利用稳定的miR-552敲减细胞系研究其对喉癌干细胞自我更新和体内成瘤能力的影响;通过生物信息学分析找到miR-552可能的下游信号分子p53,并利用经典的生物学方法验证miR-552通过p53调控喉癌细胞的生长、转移和自我更新;希望通过本项研究,能为喉癌增殖、转移及干性的调控提供新的分子机制,为喉癌诊断、治疗和预后判定分子标志物的深入研究奠定理论基础。研究方法:本研究纳入56例2019年1月-2019年6月在中国医科大学附属第一医院住院明确诊断为喉鳞状细胞癌的患者。其手术切除的喉癌组织和癌旁对照组织立即在液氮中快速冷冻,并在-80°C条件下保存,供后续分析。每位患者均已签署了知情同意书,且研究方案经中国医科大学附属第一医院医学科学研究伦理委员会批准;于中国科学院细胞库（上海）购买了M2E,M4E,TU212和Hep-2的喉癌细胞系;于中国科学院上海斯莱克实验动物有限公司购买6周龄雄性裸鼠及6周龄雄性NOD-SCID小鼠,按照SPF级实验动物饲养标准饲养。购买回来之后在动物房饲养一周以上后方进行实验,动物实验通过中国医科大学实验动物福利与伦理审查会批准。1.收集喉癌临床组织标本,利用Real-time PCR检测miR-552的表达情况,并用统计学方法分析miR-552的表达与临床病理及其他数据的相关性;2.设计构建miR-552过表达及敲减的质粒,包装慢病毒,感染喉癌M4E及Hep-2细胞系建立miR-552特异性过表达及敲减的稳定转染细胞系及其对照细胞系;3.利用miR-552 sponge和miR-552 mimic细胞及其对照细胞,采用CCK8、平板克隆形成、流式细胞周期、EDU免疫荧光等实验方法观察miR-552受干扰后对喉癌细胞体外增殖能力的影响;4.利用Hep-2的miR-552 sponge细胞及其对照细胞进行裸鼠皮下荷瘤实验,并利用免疫组织化学实验检测荷瘤组织中Ki67的表达,观察miR-552对喉癌细胞体内增殖能力的调控;5.利用miR-552 sponge和miR-552 mimic细胞及其对照细胞,采用transwell、invasion实验观察miR-552对喉癌细胞体外迁移及转移能力的调控;6.利用Hep-2的miR-552 sponge细胞及其对照细胞进行裸鼠尾静脉注射建立裸鼠体内肺转移模型实验,检测miR-552对喉癌细胞体内转移能力的调控;7.通过流式细胞仪分选或低粘附培养富集喉癌干细胞,利用Real-time PCR检测miR-552在喉癌干细胞中的表达情况;8.利用miR-552 sponge细胞及其对照细胞进行Real-time PCR实验,检测敲减miR-552后喉癌干细胞表面标志物及相关转录因子的变化;9.利用miR-552 sponge细胞及其对照细胞,进行低粘附成球培养和体外有限稀释实验,检测miR-552对喉癌干细胞自我更新能力及干细胞比例的调控;10.利用M4E的miR-552 sponge细胞及其对照细胞,进行体内有限稀释实验检测miR-552对喉癌干细胞体内成瘤能力的调控;11.通过生物信息学分析预测miR-552的下游分子,并利用经典的生物学技术Real-time PCR、western blot、荧光素酶报告基因和免疫组织化学实验在喉癌细胞、喉癌组织及裸鼠荷瘤组织中进一步验证;12.通过特异性的si RNA沉默miR-552 sponge及对照喉癌细胞中p53的表达,然后进行CCK8、平板克隆形成、transwell、invasion、低粘附成球培养和体外有限稀释等实验,验证miR-552通过p53调控喉癌细胞的进展;13.通过特异性的慢病毒过表达miR-552 sponge及对照喉癌细胞中p53的表达,然后进行CCK8、平板克隆形成、transwell、invasion、低粘附成球培养和体外有限稀释等实验,进一步验证miR-552通过p53调控喉癌细胞的进展。结果:通过一系列体内体外实验我们发现:1.Real-time PCR证实miR-552在喉癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织;晚期喉癌组织中其表达水平高于早期喉癌;四种喉癌细胞系中miR-552表达水平均较正常黏膜细胞高;运用统计学方法分析发现miR-552高表达水平的患者更倾向于有低级别的病理分级;2.通过CCK8、平板克隆形成、流式细胞周期、EDU免疫荧光、裸鼠皮下荷瘤、免疫组织化学等实验方法发现,敲减miR-552抑制喉癌细胞的生长,过表达miR-552促进喉癌细胞的生长;3.通过transwell、invasion、裸鼠肺转移等实验发现,敲减miR-552抑制喉癌细胞的迁移及侵袭能力,过表达miR-552促进喉癌细胞的迁移及侵袭能力;4.通过Real-time PCR检测发现miR-552在喉癌干细胞中表达升高;5.通过Real-time PCR、低黏附成球、体外有限稀释及体内有限稀释实验发现,敲减miR-552的表达可下调喉癌干细胞表面标志物CD133,CD44和相关转录因子SOX2,OCT4的表达,抑制喉癌干细胞的自我更新能力,降低喉癌干细胞的比例,抑制喉癌干细胞的动物体内成瘤能力;6.生物信息学分析发现p53是miR-552的下游分子,通过Real-time PCR、western blot和荧光素酶报告基因实验进一步明确miR-552通过靶向p53的3’-UTR调控其表达;对喉癌临床样本及裸鼠荷瘤组织分析发现miR-552与p53的表达呈负相关;7.沉默或过表达p53可以减弱miR-552敲减喉癌细胞及其对照细胞生长、迁移、侵袭及自我更新能力的差异,进一步明确miR-552通过下调p53来调控喉癌细胞的生长、迁移、侵袭及自我更新。结论:根据本研究可得出以下结论:喉癌组织及喉癌细胞中miR-552的表达水平呈升高趋势,肿瘤分期越晚或病理分级越低,患者喉癌组织中miR-552的表达水平越高;在喉癌中,p53可能是miR-552的直接调控靶点;miR-552能够通过下调p53促进喉癌细胞的生长、迁移和侵袭,促进喉癌干细胞的自我更新。我们的结果为喉癌生长、转移及干性的调控提供新的分子机制,为喉癌诊断、治疗和预后判定分子标志物的深入研究奠定理论基础。