1.研究背景及目的： 二乙氧基乙醇(2-ethoxyethanol，2-EE)，醇醚类化合物，无色无味，可燃，室温下呈液态，它既易溶于水，又易与乙醇、乙醚和液态酯等多种溶剂相混溶，故常作为工业涂料成膜剂被广泛应用于制造保护性涂膜、PS版感光液、油漆、涂料等领域。近年来，随着推广使用循环材料节约资源，2-EE更多地被应用于PS版的清洗及再生产，在给企业带来良好经济效益的同时，也产生了一定的职业健康危害。 随着对外源化学物认识的不断深入，关系着人类种群生存繁衍的生殖健康问题逐渐引起人们的普遍关注。研究证实，长时间暴露于较高浓度2-EE中可引起动物神经、血液、肾脏的损害，而低浓度时则主要导致实验动物的生殖系统损伤。目前有关2-EE的研究主要集中于对其生殖毒性机制的探讨上，从生化机制向分子机制逐步深化。由于2-EE具有脂水共溶性的理化特点，很容易透过血睾屏障引起雄性生殖系统损伤，因此，北欧环境化学物生殖毒性判定标准将其归为I组B类，即对人可能具有生殖毒性的外源化学物。 自上世纪90年代起，生物学标志物的概念和检测方法逐步引入对外源化学物的生物监测和危险度评价过程，对2-EE暴露标志物和易感性标志物的研究也因此取得了很大的进展。同时，随着分子生物学的发展，越来越多的基因被发现参与了重要的生殖调控过程，一些睾丸毒性诱发模型证明了激活的凋亡相关基因可诱发生精细胞凋亡，从而造成生精细胞损伤。在我们以往的实验中，也发现2-EE睾丸生精上皮毒性的病理表现同时具有睾丸生精细胞凋亡的细胞特异性和生精上皮周期特异性，这为2-EE生殖毒性机制的研究提供了重要的理论基础。 因此，本实验研究目的旨在于分析2-EE对雄性大鼠生殖系统毒性的可逆性作用特点、2-EE诱发生精细胞凋亡的细胞形态学变化特点及其基因调控途径，从而进一步探讨2-EE生殖毒性的作用机制，填补2-EE在生殖毒性恢复性试验研究与预测方面的空白。 2.材料与方法：2.1实验动物选择、染毒方法与剂量选用健康成熟雄性Wistar大鼠，随机分为3个实验组及1个对照组。3个实验组分别以400、800、1200mg/kg BW/day 2-EE经口灌胃染毒1周，制成2-EE染毒实验动物模型，对照组以等量生理盐水代替。恢复模型是在染毒模型的基础上，停止染毒后分别继续饲养1至4周。分别于末次染毒后1天、7天、14天、21天、28天分批处死各组动物，用于2-EE致大鼠睾丸生殖毒性恢复试验，睾丸生精细胞Bax、Cyt C和Caspase-3蛋白免疫组化试验以及凋亡相关基因fas、fasl、bax，bcl-2、caspase-3转录水平的检测。 另选健康成熟雄性Wistar大鼠，随机分为实验组及对照组。实验组以800mg/kg BW/day 2-EE经口灌胃染毒1周，制成2-EE染毒模型，对照组以等量生理盐水代替。恢复模型是在染毒模型的基础上，停止染毒后继续饲养4周。分别于末次染毒后第1天、第28天分批处死各组动物，用于2-EE致大鼠睾丸生精细胞损伤的超微结构观察。 2.2实验方法采用普通病理实验技术及透射电镜技术对2-EE致大鼠睾丸生殖毒性恢复性进行研究。普通病理样品通过常规组织固定、石蜡切片、HE染色后，观察睾丸生精小管结构及生精细胞病变情况，并利用图像采集软件对生精小管横截面直径进行测量。电镜样品制备要求处死动物后迅速取出睾丸组织，经2.5％戊二醛(电镜用，4℃)前固定，2％四氧化锇后固定，梯度脱水，树脂包埋，制成300nm的半薄切片，组织定位后，制成60nm的超薄切片，经醋酸铀、柠檬酸铅染色，于透射电镜下观察生精细胞超微结构的变化。 采用免疫组织化学法(SP法)检测Bax、Cyt C、Caspase-3蛋白在大鼠睾丸生精细胞中的表达，一抗分别为兔抗大鼠Bax多克隆抗体、小鼠抗大鼠Cyt C单克隆抗体、兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗体，阴性对照以PBS代替。经DAB显色，苏木精复染后，胞浆呈棕黄色的细胞定义为Bax，Cyt C，Caspase-3蛋白表达阳性细胞，计算阳性细胞率。 采用RT-PCR对2-EE致睾丸生精细胞凋亡相关基因fas、fasl、bax、bcl-2、caspase-3的转录水平进行检测。利用RNeasy Mini试剂盒，从液氮保存的睾丸组织中提取总RNA，并对其进行纯化及RNA完整性分析，ND-1000分光光度计检测总RNA的含量，利用SuperScript Ⅲ反转录试剂盒反转录合成cDNA。反转录后，以反转录产物作为PCR反应的模板，针对fas、fasl、bax、bcl-2、caspase-3等凋亡相关基因设计特异引物进行PCR扩增，PCR产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳后，利用Gel-Doc凝胶电泳成像系统生成图像文件，用于半定量分析。 数据分析方法采用SPSS 12.0对各指标进行单因素方差分析并进一步用Dunnett-t检验进行实验组与对照组之间的两两比较。 3.结果： 2-EE致大鼠睾丸生殖毒性恢复试验睾丸组织病理结果显示，染毒1周后，实验组大鼠睾丸实质内曲细精管萎缩，生精细胞排列紊乱，成熟精子减少甚至消失，其受损程度随染毒剂量的升高而加重。随着恢复时间的增加，曲细精管生精细胞损伤情况逐渐好转，自然恢复4周后，与相应的染毒模型比较，恢复模型的曲细精管内细胞增多，各级生精细胞排列有序，基本接近对照组水平。透射电镜下观察睾丸生精细胞的超微结构，其结果显示，染毒1周后，实验组睾丸生精细胞内出现细胞核皱缩，染色质凝集，线粒体肿胀等现象，具有典型的细胞凋亡的特征。染毒模型恢复4周后，睾丸生精细胞的细胞核、细胞器基本未见异常。 经2-EE染毒1周后，Bax、Cyt C、Caspase-3蛋白在大鼠睾丸生精细胞中的表达明显增加，阳性细胞百分率明显上升。高倍镜下观察各级生精细胞，Bax、Cyt C、Caspase-3蛋白在大鼠睾丸生精细胞中均存在表达易位现象，反映了细胞凋亡系统的活化。随着恢复时间的增加，实验动物睾丸生精细胞内Bax、Cyt C、Caspase-3蛋白阳性表达水平在实验组与对照组之间的差异逐渐缩小，经过4周的自然恢复，Bax、Cyt C、Caspase-3蛋白阳性细胞百分率基本接近对照组水平。凋亡相关基因fas、fasl、bax、bcl-2、caspase-3转录水平检测结果显示，经2-EE染毒1周后，大鼠睾丸组织内bax，caspase-3基因转录水平明显升高，fas基因转录水平有所升高，fasl、bcl-2基因转录水平变化不明显。自然恢复4周后，各剂量组fas、fasl、bax、bcl-2，caspase-3等基因的转录水平基本接近对照组水平。 4.结论： 2-EE所致的睾丸毒性作用主要表现在生精细胞损伤、分化障碍、精子生成减少等方面，从而影响雄性生殖功能；这种睾丸毒性存在一定的可逆性，在停止染毒后，通过4周的自然恢复，基本接近对照组水平。2-EE睾丸毒性及其恢复性的作用机制可能与2-EE诱发睾丸生精细胞凋亡有关，受bax、cyt c、caspase一3等凋亡调控基因的影响，主要通过内源性途径对其生精细胞凋亡进行调控。2-EE睾丸毒性及其恢复性的探讨与预测为完善此类生殖毒物的危险度评价、相关卫生标准的制定和职业接触者的健康监护提供了科学依据与新的思路。