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胃泌素释放肽（Gastrin-releasingpeptide,GRP）是1979年从猪的胃组织中分离得到的一种神经肽,是哺乳动物蛙皮素样肽家族中的一员,在体内GRP通过与其受体（Gastrin-releasing peptide receptor,GRPR）结合发挥多种生理功能。GRP及其受体在多种动物的神经系统和外周组织中广泛表达,参与调控体内多种生物学作用,包括:促进正常/肿瘤细胞的增殖分化、促进胰液分泌、调节应激和恐惧等情绪性行为、参与调控摄食和节律等。自GRP发现以来,目前大多数关于GRP及其受体功能的研究都集中于人和大小鼠上,关于猪体内GRP的表达及其生物学作用的研究较缺乏。为研究GRP在猪体内的分布情况,我们首先制备了猪GRP多克隆抗体,并研究了GRP蛋白在猪体内的分布。本课题组前期研究结果表明,GRP可能对公猪的生殖功能具有调控作用,因此本试验以猪Leydig cells为模型,研究GRP对猪Leydig cells睾酮分泌/合成、增殖及凋亡的影响。通过以上研究旨在发现GPR在猪体内可能存在的生理功能及对猪Leydig cells的影响,为进一步研究GRP对公猪生殖相关激素的调控机制奠定基础。1.猪GRP多克隆抗体的制备本试验通过大肠杆菌原核表达技术,构建了重组表达载体pET32a（+）-pGRP,并转化到表达菌株BL21（DE3）获得pGRP融合蛋白表达菌株,IPTG诱导表达菌株获得Histag-pGRP融合蛋白,以纯化后的融合蛋白为免疫原,制定免疫程序免疫试验动物后获得抗血清,即为制备的多克隆抗体。具体如下:（1）根据猪GRP基因序列,设计并合成添加酶切位点的引物序列;通过PCR扩增获得pGRP目的片段,包括全长开放阅读框（441 bp）,编码146个氨基酸;随后与pMD19T连接构建pMD19T-pGRP重组质粒;将pMD19T-pGRP和pET32a（+）质粒经双酶切线性化后连接构建pET32a（+）-pGRP重组表达载体;并转化至表达菌株BL21（DE3）中获得BL21（DE3）-pET32a（+）-pGRP融合蛋白表达菌株。（2）利用IPTG诱导BL21（DE3）-pET32a（+）-pGRP融合蛋白表达菌株获得His-tag-pGRP融合蛋白,并对获得的蛋白进行检测和纯化。（3）制定免疫程序后,以纯化后的融合蛋白为免疫原免疫试验动物家兔,并获得抗血清;采用ELISA检测抗血清的效价为1:50,000,并通过Western Blot检测抗血清的反应原性;纯化后的抗血清即为制备的多克隆抗体。2.GRP在猪体内的分布定位和表达本部分主要通过IHC和Western Blot检测GRP蛋白在猪组织中的分布表达情况。结果表明:GRP蛋白在猪的中枢神经系统和外周组织器官中都有表达,其中在中枢神经系统GRP蛋白主要表达在下丘脑、小脑等组织;在外周组织中主要表达在胃肠道和泌尿生殖道。综上所述,GRP蛋白在猪体内的广泛存在表明GRP可能对猪的多种生理功能具有调节作用。3.GRP对猪Leydigcells的影响为研究GRP对猪Leydig cells的影响,我们使用一定浓度的GRP处理猪Leydig cells,收集上清和蛋白样品分别进行如下检测:检测GRPR蛋白在Leydig cells中表达,结果表明一定浓度（1和10 nM）的GRP可以显著促进GRPR蛋白的表达;检测上清中睾酮分泌和睾酮合成相关蛋白（StAR、CYP11A1和HSD3B2）表达的影响,结果表明GRP能够促进睾酮的分泌,其中1和10nM的GRP能够显著增加睾酮的浓度（P<0.01和P<0.05）;Western Blot结果也表明不同浓度GRP处理细胞对睾酮合成相关蛋白（StAR、CYP11A1和HSD3B2）的表达有一定的促进作用;进一步检测了GRP对Leydig cells细胞增殖和凋亡的影响,CCK-8结果表明GRP对细胞活性有一定的作用,GRP浓度为1和10nM时能够显著增加细胞数量（P<0.01和P<0.05）;Western Blot检测结果表明一定浓度的GRP对Cyclin B1蛋白表达有促进作用,但是对PCNA影响不显著;同时流式细胞术检测结果表明一定剂量的GRP能够促进细胞凋亡并促进凋亡相关蛋白的表达;检测了GRP处理对G-蛋白偶联受体信号通路中pPKC/PKC和pPKA/PKA蛋白表达的影响,结果显示一定浓度的GRP能够增加pPKC/PKC的比值,但是对pPKA/PKA的比值影响不显著。该论文构建重组表达载体pET32a（+）-pGRP并制备猪GRP多克隆抗体,通过IHC和Western Blot检测GRP蛋白猪体内的分布和表达情况,结果表明GRP蛋白在猪组织中具有广泛的分布表达,表明GRP在猪体内可能具有多种生理功能。该论文进一步研究GRP对猪睾丸间质细胞睾酮的分泌和合成的影响,结果表明一定浓度的GRP能够促进睾酮分泌并调节睾酮合成相关蛋白的表达;另外,研究结果还表明一定浓度的GRP对睾丸间质细胞的细胞增殖和凋亡也有影响;并发现GRP/GRPR系统对睾丸间质细胞的调节作用可能是通过pPKC/PKC途径。