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OrfV（Orf virus,OrfV）属于痘病毒科、副痘病毒属成员,为有囊膜线性双股DNA病毒,是引起绵羊、山羊发生以口唇、舌、鼻、乳房等部位皮肤、黏膜形成丘疹、脓疱、溃疡以及形成疣状结痂为主要特征的接触性、嗜上皮性、人兽共患传染病病原。国内外的研究已证明该病毒是一种变异性较强的病毒,不同国家和地区分离的病毒在致病性上存在着较大差异,基因组限制性酶切图谱分析表明也存在差异。可以持续增殖病毒的细胞是研究病毒最重要的工具之一。羔羊或犊牛睾丸细胞是OrfV增殖的易感细胞,但获得受来源限制,且原代细胞存在获取过程复杂及大量使用实验动物;OrfV在传代细胞上的培养,存在传代后毒力减弱、细胞病变（CPE）不稳定性等问题,因此羊口疮病毒体外增殖是一个重要技术瓶颈,直接影响了对OrfV生物学特性进行基础研究和实践中OrfV相关生物制品的开发。为了获得OrfV地方流行毒株,为OrfV基础研究和疫苗生产提供资料而开展了以下研究:1.羊口疮病毒大足株（OrfV-DZ）的分离与鉴定本研究采集重庆荣昌、大足等地区多个羊场疑似羊口疮病料18份,提取DNA,PCR鉴定为阳性病料常规处理,接种羔羊睾丸细胞（LT）进行OrfV的分离,并通过CPE观察、间接免疫荧光试验（IFA）、PCR扩增、测序、同源性分析和动物感染试验对细胞培养物进行鉴定。结果:采集样本经PCR检测,羊口疮病毒核酸阳性率为61.1%（11/18）,阳性样本分别接种LT,连续传至第5代,大足样本在接毒后36 h左右出现长梭型细胞变圆、融合、皱缩,72 h左右大部分细胞脱落;间接免疫荧光试验（IFA）可以在细胞浆中检测到绕核特异性荧光;提取F4和F5代细胞毒DNA,PCR能扩增出特异性目的条带（1137 bp）,测序后,与GenBank中19株OrfV-B2L基因核苷酸及编码蛋白的同源性为97.9%100%;测定F5代细胞培养物的TCID50值为10-5.68/0.1mL;将F5代细胞毒1 mL口唇部划痕接种1月龄山羊,出现与羊口疮一致的临床症状。2.基于PMA-PCR技术检测活OrfV方法的建立本研究在分离得到OrfV-DZ株的基础上(TCID50为10-5.68/0.1mL),通过对热水浴灭活OrfV的温度（50、60、70和80℃）、PMA与灭活羊口疮病毒DNA结合的最佳浓度（0、5、10、15、20、25μmol/L）和卤素灯光照作用时间（5、10、15、20 min）进行优化,建立了PMA-PCR检测Orf活病毒的方法,并对该方法进行敏感性、特异性试验。结果:通过CPE观察,60℃以上热水浴能够灭活OrfV;PMA与灭活羊口疮病毒DNA结合的最佳浓度范围为2040μmol/L,在距离500 W卤素灯20 cm处照射15 min,能够与灭活的OrfV(10-5.68 TCID50/0.1 mL)DNA充分结合,并抑制灭活羊口疮病毒DNA的PCR扩增,且不影响活羊口疮病毒的PCR扩增;建立的PMA-PCR方法检测活羊口疮病毒的最低浓度为10-2.68TCID50/0.1mL,且特异性良好。3.羊口疮病毒大足株（OrfV-DZ）在不同细胞系上的增殖特性研究本研究将在羔羊睾丸细胞（LT）上分离的OrfV-DZ株F5代细胞毒分别接种2种原代细胞:犊牛睾丸细胞（BT）和鸡胚成纤维细胞（CEF）;接种7种传代细胞:非洲绿猴肾细胞系（Vero）、牛肾细胞（MDBK）、乳仓鼠肾细胞（BHK-21）、狗肾细胞（MDCK）、宫颈癌细胞系（Hela）、山羊皮肤成纤维细胞（GSFs）、小鼠皮肤成纤维细胞（NIH3T3）,通过观察细胞病变（CPE）出现时间、TCID50测定、间接免疫荧光试验（IFA）、PMA-PCR和SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测OrfV-DZ株在不同细胞系的增殖特性。结果:OrfV-DZ株F5代细胞毒接种BT细胞在F3代24 h出现细CPE,接种CEF细胞传至F5代仍未见CPE;接种MDBK细胞在F5代36 h出现CPE,接种Hela细胞在F5代48 h出现CPE,其他5种传代细胞盲传至第5代仍未见CPE;收集BT、MDBK和Hela细胞培养的F5代细胞毒,测定TCID50值分别为:10-5.27/0.1mL,10-4.86/0.1mL、10-4.57/0.1mL;在BT、MDBK和Hela细胞浆中能检测到特异性绕核荧光;PMA-PCR方法分别在BT、MDBK和Hela细胞的18代、18代和15代细胞毒中检测到活OrfV;OrfV-DZ在LT中18代扩增病毒拷贝数分别为3.02×107、1.32×107、3.02×107、4.17×107、5.01×107、3.09×107、2.30×107、2.57×107copies/μL;在MDBK细胞中18代扩增病毒拷贝数分别为7.76×106、5.89×107、4.07×107、2.88×107、2.11×106、1.29×106、9.33×105、7.59×105copies/μL;在Hela细胞15代扩增病毒拷贝数分别为6.46×107、9.33×106、6.17×106、2.0×106、1.38×105copies/μL,结果表明OrfV-DZ株在MDBK、Hela中随着传代增多,病毒拷贝数逐渐减少,因此得到适合OrfV-DZ增殖的细胞系为羔羊睾丸细胞（LT）和牛睾丸细胞（BT）。结论:本试验成功从发病羊群分离到一株羊口疮病毒,命名为OrfV-DZ株;建立了PMA-PCR方法可以对OrfV活病毒进行检测;筛选得到适合OrfV-DZ株增殖的最适细胞系为羔羊睾丸细胞（LT）和牛睾丸细胞（BT）。