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目的:类金属元素砷是一种环境氧化应激物,长期暴露可以导致皮肤病变和多种实质性脏器损害,还能诱导多种恶性肿瘤的发生。另外,大量人群流行病学研究发现环境砷暴露与2型糖尿病的发生发展密切相关。2型糖尿病的病理生理基础是胰岛素合成及分泌受损和胰岛素抵抗。胰岛β细胞合成和分泌胰岛素,其功能障碍是糖尿病病人血糖升高的直接原因之一。因此,研究胰岛β细胞的功能在阐明砷致糖尿病的病理机制中至关重要,具有重要的公共卫生学意义。本课题组前期研究发现MIN6胰岛β细胞中的核转录因子NRF1(Nuclear factor E2-related factor 1,也称NFE2L1)长亚型缺失对急性砷暴露引起的细胞损伤更敏感,提示长亚型NRF1在砷导致胰岛β细胞急性损伤过程中起到了重要的保护作用。小鼠Nrf1基因可转录生成多个转录本,翻译生成多种蛋白亚型,但这些亚型在砷暴露的胰岛β细胞中表达尚不明确,我们通过检测三价无机砷暴露对胰岛β细胞中各亚型Nrf1的表达,发现其短亚型升高明显,因此本研究课题的开展将以短型NRF1为中心,旨在探讨其在急性三价无机砷暴露导致胰岛β细胞损伤中的作用及机制。研究方法:利用RT-qPCR和Western Blot技术检测MIN6细胞和小鼠胰岛在急性三价无机砷处理后NRF1各亚型的表达,利用胞浆与核蛋白提取试剂盒进行细胞组分分离,并检测NRF1蛋白在不同细胞组分中的水平;利用慢病毒稳定转染系统对MIN6细胞进行转染,构建过表达对照细胞OE-Cont和过表达短型NRF1细胞OE-583和OE-453,利用Western Blot技术对NRF1蛋白水平进行验证;对上述OE-Cont、OE-583和OE-453细胞进行急性砷暴露,利用台盼蓝染色方法检测细胞毒性,利用CCK试剂盒检测细胞活力,利用Western Blot技术检测凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3,利用流式细胞仪测定细胞周期变化;利用RT-qPCR技术对OE-Cont、OE-583和OE-453 MIN6细胞中抗氧化酶基因、凋亡进程相关基因、蛋白酶体稳态基因、II相解毒酶基因及影响砷吸收与外排相关基因的表达进行定量分析;利用原子荧光分度计对细胞内和培养液中总砷浓度进行检测;构建短型Nrf1不同长度启动子区报告基因质粒,转染至MIN6细胞并给与砷处理后进行荧光素酶活性检测;利用RT-qPCR技术对MIN6细胞急性砷处理后Nrf1各亚型的mRNA稳定性进行定量分析。结果:1.急性三价无机砷暴露可诱导MIN6细胞和小鼠原代胰岛中短型NRF1表达明显增加,且短型NRF1蛋白主要集中在细胞核。2.对OE-Cont、OE-583和OE-453 MIN6细胞进行NRF1蛋白验证,确认各短型NRF1分别在MIN6细胞中被有效过表达。3.短型NRF1过表达MIN6细胞急性砷暴露后,CCK检测和台盼蓝染色结果显示,存活细胞数和细胞活性均高于对照细胞,且具有统计学差异;在OE-583和OE-453 MIN6细胞中凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3水平明显低于对照细胞,且与流式细胞仪检测结果一致,表明死亡细胞数少于对照细胞。4.急性砷暴露后,抗氧化基因Gclc、Gclm和Ho-1的mRNA水平在短型NRF1过表达MIN6细胞中没有增加;与凋亡过程相关的基因Irf1、Mapt、Rassf5和Bnip3,蛋白酶体亚单位基因PsmB4和PsmB6,以及II相解毒酶基因Nqo1、Gsto1和Gstm1的mRNA水平在OE-Cont和OE-583、OE-453细胞中均无统计学差异;短型NRF1过表达MIN6细胞内总砷浓度与对照细胞相比有降低的趋势,且检测到ABCC家族相关基因m RNA水平明显高于对照细胞。5.短型Nrf1启动子报告基因检测发现,砷处理并不影响短型Nrf1的转录。但mRNA稳定性分析发现砷暴露可以减缓短型Nrf1 mRNA的降解速率。结论:短型NRF1参与胰岛β细胞应对砷暴露引起的急性应激反应,并通过上调砷代谢外排相关基因,使细胞内总砷浓度有降低的趋势,减轻了细胞损伤。