苏云金杆菌HZM2菌株的基因鉴定及对毒死蜱的降解作用

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:kingly1988
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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是自然界中一种分布广泛的革兰氏阳性产孢细菌,占据着全世界95%的微生物农药市场。除了对许多目的昆虫具有特异性的毒杀作用外,Bt还直接或间接地对线虫、螨类、原生动物甚至一些病原菌具备一定的活性。Bt具备这些特性,主要是因为它体内含有多种毒性因子,例如杀虫晶体蛋白(ICPs)、营养期杀虫蛋白(VIPs)、几丁质酶、AiiA和InhA等等,其中,ICPs是最为重要的杀虫活性因子。随着人们对Bt的研究不断深入,Bt的应用领域已经不仅只局限于农业和林业上,在医学上甚至工业上也能起到一定的作用,并且不断有研究人员拓展Bt的应用领域。基于以上原因,本研究不但着眼于研究Bt常规的杀虫特性,从工业污染源中分离Bt菌株,测定它们的生理生化指标、对小菜蛾、甘薯茎线虫和桔小实蝇的活性,还分析其中的1个菌株HZM2的活性基因,克隆其中的cry基因,并尝试将Bt用于降解有机磷农药,鉴定了该菌对有机磷农药毒死蜱的降解能力。应用醋酸钠-抗生素加热处理的分离方法,对从工业污染源收集的220份样品进行了分离,从中得到6株Bt菌株,出菌率为2.7%。对新分离的这6株菌株的生理生化指标的鉴定表明,这6株菌株的生理生化指标均不完全相同。生物活性测定表明菌株HZM2对小菜蛾和甘薯茎线虫的活力均为所有分离菌株中最高的,LC50分别为1.91μL/mL和10.93μL/mL。运用PCR-RFLP和PCR技术对菌株HZM2的部分生物活性基因进行了鉴定,结果显示HZM2含有crylAa、crylBa、crylEa、crylIa和cry2Ab等ICPs基因及vip3A、inhA、几丁质酶基因和aiiA等活性基因。从HZM2菌株中克隆得到1个crylEa基因。该基因全长3516 bp,蛋白编码1171个氨基酸,蛋白分子量和等电点通过软件预测分别为133.18 kDa和5.01。该基因已在GenBank上登录(登录号为EU244426),并被Btδ-内毒素命名委员会命名为crylEa8,成为Bt cry基因家族中1个新的成员。利用生物信息学软件分析编码crylEa8基因的氨基酸序列,结果表明在该蛋白的二级结构中,螺旋结构占24.68%,折叠结构占30.66%,成环结构占44.66%,CrylEa8蛋白的三维空间结构应该是球状结构,但不像结构域一样紧密。结构域预测表明,CrylEa8由3个结构域组成,结构域Ⅰ由219个氨基酸残基(Thr35to Leu253)组成;结构域Ⅱ由197个氨基酸残基(Thr258to Thr454)组成;结构域Ⅲ由138个氨基酸残基(Ile464to Asp601)组成。其中N-末端螺旋状结构域与膜插入和孔隙形成有关,而第2和第3个结构域与受体的结合有关。此外,本研究首次鉴定Bt菌株对有机磷农药的耐受性及降解率。菌株HZM2对毒死蜱的耐受力可达1600 mg/L,利用气相色谱(GC)检测技术分析该菌株对毒死蜱的降解率,该菌株在48 h内对200 mg/L毒死蜱的降解率为88.9%。实验结果证明,HZM2菌株对高浓度毒死蜱具有较好的耐受力并具有很高的降解活性。
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