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目的：构建以pcDNA3.1(-)为载体的反义uPAR基因真核表达质粒。
方法：反义uPAR质粒的构建和鉴定：取-80℃冰冻保存的大鼠肝癌组织,应用Trizol法提取细胞总RNA,1.5％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度。使用二步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒获得目的基因uPAR片段。用Cacl2法诱导感受态细胞。将纯化回收的pcDNA3.1(-)线性化载体和uPAR基因片段连接,构建以pcDNA3.1(-)为载体的反义uPAR基因真核表达质粒。转化JM109大肠杆菌。以重组后的质粒为模板行菌落PCR反应,证实其正确性。测序分析其正确性。
结果：
1.琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,见28S,18s条带完整,而且28S条带亮度为18S的1倍左右,认为RNA完整性良好,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA纯度A260/A280=1.9051,认为RNA纯度良好；RNA浓度为450mg/L;
2.RT-PCR扩增后,1％琼脂糖凝胶电泳,在DNA Marker500bp附近可见明显条带,与所需目的片段大小相符；
3.阳性克隆质粒经菌落PCR反应后行1％琼脂糖凝胶电泳在DNAMarker500bp附近可见明显条带,与所需目的片段大小相符,证实为阳性克隆,重组质粒构建成功。DNA测序结果与预期目的片段序列一致。
结论：成功构建反义uPAR/pcDNA3.1(-)真核细胞表达质粒。