自身免疫病(Autoimmune Disease, AID)是一类广泛影响人类健康的免疫系统疾病,其发病进程缓慢、对机体破坏严重。目前普遍认为是由于T细胞识别自身抗原并逃逸机体正常的免疫调节而发生。自身免疫病的治疗目标是修补特定的免疫缺陷或改变整个免疫反应,在不破坏正常免疫防御的前提下终止自身免疫反应的破坏作用。目前其治疗极具挑战性,临床通常采用糖皮质激素和免疫抑制剂等生化药物进行治疗,虽有一定的疗效但长期使用不可避免的带来很多毒副作用,使患者病情得到缓解的同时增加了发生肿瘤和感染扩散的危险。近些年发展起来的生物学治疗方法,由于其能够基于该类疾病发病机制中的不同环节进行特异性治疗,疗效专一、毒副作用小,而为自身免疫病的治疗开拓了新的途径与希望。目前生物学治疗方法有：针对T细胞、B细胞的生物学治疗,针对T-B细胞间相互作用的生物学治疗,针对细胞因子的生物学治疗以及针对特定免疫病的治疗性肽疫苗的生物学治疗。调节性T细胞(Regulatory T Cell, Treg)是一类具有免疫调节作用的T细胞亚群,可有效抑制T细胞的活化与增殖,在维持机体免疫耐受、免疫应答稳态和防止自身免疫性疾病的发生中起重要作用。来自胸腺的天然型Treg细胞(主要为CD4+CD25+Foxp3+Treg, nTreg)不但能抑制效应T细胞的活化与增殖,尚能诱导其他CD4+T细胞向抑制性T细胞的转化。有研究表明自身免疫病患者体内Treg功能或数量上存在一定的缺陷,因此诱导患者自身Treg细胞亚群的增殖成为生物治疗的新途径,也即是Treg细胞过继输注治疗自身免疫病的意义所在。然而天然Treg细胞在外周循环中数量极少,实验常以体外诱导扩增Treg细胞过继输注而进行治疗,但是体外诱导扩增的CD4+Treg细胞性质不够稳定,在炎症因子条件下较易转化为效应T细胞。有实验报道供者特异性的CD8+Treg细胞可在体外特异性诱导并扩增,且扩增后的CD8+Treg细胞性质稳定,可有效抑制致敏T细胞的增殖和炎症因子的分泌,在体内优先转移到引流淋巴结在该处诱导CD4+Treg的生成,从而起到减轻异基因皮肤移植移排斥反应。尽管如此,体外诱导扩增的CD8+Treg细胞对自身免疫病的治疗作用鲜见报道,且供者特异性的CD8+Treg应用于临床治疗滞后于疾病的发生而不够及时,而广谱扩增的CD8+Treg细胞因其无特异性而可储存以备使用。因此如何体外诱导、大量扩增获得性质与功能稳定的CD8+Treg细胞进而对自身免疫病过继输注治疗则显得较为重要。也即是本课题的研究意义所在。本实验主要采用了人外周血PBMC中新鲜分离的CD8+T细胞在Anti-CD3/CD28包被的磁珠刺激下,同时添加IL-2,在TGF-β、雷帕霉素(Rapa)联合诱导条件下进行培养,对得到的CD8+Treg细胞进行四轮重复刺激的广谱扩增,对得到的第一轮与第四轮Treg细胞的纯度、活性、扩增能力、表型、无能性、体外抑制功能等进行鉴定,以测定Treg细胞体外扩增能力及随着多轮扩增的进行CD8+Treg在细胞水平上的稳定性,实验结果表明,TGF-β、Rapa联合诱导的CD8+Treg细胞可在体外大量扩增并具有显著的体外抑制功能,并且随着多轮扩增的进行,其活性、纯度、表型、无能性、抑制功能等维持稳定。本文构建了自身免疫病常见的实验动物模型－胶原诱导性关节炎CIA小鼠模型(Collagen-induced Arthritis, CIA)和实验性自身免疫性脑脊髓炎EAE小鼠模型(Experimental Autoimmune Encephalitomyelitis, EAE).过继输注体外诱导扩增的第一轮和第四轮CD8+Treg细胞,以检测CD8+Treg细胞对自身免疫病CIA和EAE模型小鼠的治疗作用及作用机理。实验结果表明,Treg田胞可以通过影响CIA小鼠脾脏中CD4+T细胞的亚型、降低病理组织中与炎症发生相关细胞因子的mRNA水平和下调mDC表面CD80/CD86的表达,有效地缓解CIA和EAE模型发病症状,减轻CIA和EAE模型的严重程度,对CIA和EAE模型小鼠的治疗作用显著。且随着体外多轮扩增的进行,第一轮和第四轮的CD8+Treg田胞对CIA和EAE模型小鼠的治疗能力无显著性差异。