肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）是一种常见的呼吸道病原体（RTIS）,具有很强的传播感染能力,往往可引起严重的上呼吸道感染疾病,其中包括发生在世界各地所有年龄组的社区获得性肺炎（CAP）。此外,肺炎支原体可同时导致神经系统损伤,并且与多种其他急性慢性疾病相关联。由于许多呼吸道病毒,包括甲型流感（Influenza A virus）和乙型流感病毒（Influenza B virus）等,也可引起发烧、咳嗽、喉咙痛等呼吸道感染疾病症状,在临床上很难区分开,对病原体的准确诊断对于疾病的治疗意义重大。医院对于肺炎支原体的检测包括培养法、ELISA法检测Ig M和或/Ig G,免疫层析法检测抗原,但这几种方法往往需要几天的时间才可以出检测报告,不利于疾病的前期治疗与防控,以PCR为主的核酸扩增技术（NAATs）因其灵敏度高,特异性好,操作简单等优点逐渐成为呼吸道感染检测的金标准。例如2019年爆发的新型冠状病毒（SARS-Co V-2）,在此疫情期间,核酸检测为主要的检测方法,在疫情防控期间发挥重大作用,因此开发一种高效快速的检测方法是必要的。本课题组之前开发了变性泡介导的等温核酸扩增（Denaturation bubble-meditated strand exchange amplification,SEA）,我们在此基础上对检测方法进一步研究优化,通过加入一个短暂的高温与低温过程进而加快扩增速度,由于较高的温度更有效促使双链DNA（ds DNA）产生变性气泡,因此我们在变性温度和复性温度之间采用狭窄的热循环来代替等温过程,该过程称为加速链交换扩增（ASEA）,可以在20-30 min内完成检测。本论文通过设计优化呼吸道病原体特异性引物,对病原体的核酸进行快速检测,并检测临床样本评价其实用性,以达到对呼吸道病原体简单、快速、精准的检测目的。第一部分是ASEA扩增引物的设计与优化。本论文选择三种病原体作为研究靶标,一为肺炎支原体,遗传物质为DNA;另外两种是甲型流感和乙型流感病毒,其遗传物质为RNA。首先对这三种不同靶标进行核酸的快速提取,本论文使用的是磁珠法提取核酸。随后分别设计四对特异性引物,通过NUPACK等对其进行评估,结果表明肺炎支原体的四对引物中的第三对,甲型流感病毒的第四对以及乙型流感病毒的第一对为最优引物,其他九对引物都存在引物二聚体或二级结构,不适用于接后续研究。考虑到ASEA检测方法存在一个短暂的高温与低温过程,所以需要对引物的反应温度进行优化,结果显示肺炎支原体最适温度为高温74℃,低温58℃,甲型流感病毒乙型流感病毒的最适温度为高温74℃,低温60℃。第二部分是呼吸道病原体的快速检测。这一部分通过对肺炎支原体、甲型流感病毒以及乙型流感病毒的可行性、特异性以及灵敏性进行研究,结果表明,ASEA可用来检测呼吸道病原体,并且本方法特异性良好,检测肺炎支原体可与其他9种同样引起类似疾病的致病菌区分开,可从多种病原体的DNA混合物中检出1%的肺炎支原体基因组DNA,且ASEA的检出限（LOD）低至1.0×10-17M,约120 copy每反应;对甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测也可与和呼吸道合胞病毒、腺病毒等区分开,RNA的检出限（LOD）可检测到1.0×10-15M,约12000 copy每反应,均可满足临床检测要求。第三部分是ASEA临床样本的检测及其与PCR的对比研究。用ASEA方法对从青岛大学附属医学院得到的肺炎支原体病人咽拭子样本进行检测,并将本方法检测结果与Real-Time PCR检测结果进行比较,结果显示,在对肺炎支原体的临床样本检测中,50例咽拭子样本,其中包括26例阳性样本,24例阴性样本,本方法检测结果显示25例阳性,24例阴性,结果显示本方法存在一例假阴性结果,进而对这一例假阴性结果进行检测表明,这一例样本病毒含量低于ASEA方法的检测限,因此出现假阴性结果。本论文结果显示ASEA方法可用于呼吸道病原体的检测,对DNA与RNA靶标校测特异性好、灵敏性高,并且可在30 min内完成检测;对于肺炎支原体临床样本阳性检出率96.15%,阴性检测率100%,可满足临床检测要求,本方法对于流感等疾病的预防有重要意义。