【摘 要】
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生长分化因子11(GDF11)是转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一种分泌型信号分子,又称为骨形态发生蛋白11(BMP11)。从1999年发现至今,对GDF11的研究主要集中于其在早期胚胎发
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生长分化因子11(GDF11)是转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一种分泌型信号分子,又称为骨形态发生蛋白11(BMP11)。从1999年发现至今,对GDF11的研究主要集中于其在早期胚胎发育中的调控作用,特别是在中轴骨骼的图式形成以及肾发生中的作用。体长是猪育种中的一个重要的经济性状,其长短与胸腰椎数密切相关。因此,研究DNA去甲基化对猪GDF11表达的影响,对于了解猪体长变异的表观遗传机制,具有重要科学意义和潜在的应用价值。本研究可以分为两个部分:第一部分:用DNA甲基化抑制剂5-azaC处理猪肾近端小管上皮细胞系LLC-PK1,提取细胞总RNA,运用RT-PCR和半定量PCR的方法分析不同的处理浓度和处理时间对猪GDF11表达的影响。结果表明:处理24h后0.5、1和3μM 5-azaC处理组之间GDF11的相对表达量差异显著(P<0.05);处理48h后差异不显著;处理72h后,0.05、0.1、0.3、0.5、1和3μM 5-azaC处理组之间差异显著(P<0.05)。在每个处理浓度下,处理24、48和72h后GDF11的相对表达量差异极显著(P<0.01)。第二部分:根据GenBank公布的猪GDF11序列设计引物,利用来自6.5cm猪胚肾cDNA作为模板,通过PCR的方法克隆编码猪GDF11蛋白羧基末端327个氨基酸的cDNA序列,将此序列连接入原核表达载体pGEX-6p-1中,测序验证表明重组质粒pGEX-6p-1-GDF11构建成功。将重组的表达质粒pGEX-6p-1-GDF11转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,使用IPTG诱导目的蛋白的表达,经SDS-PAGE验证表明,融合蛋白GST-GDF11在大肠杆菌中得到成功表达。利用电洗脱的方法对GST-GDF11融合蛋白进行初步纯化,SDS-PAGE结果表明,得到纯度较高的融合蛋白GST-GDF11。
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