最为理想的生物材料就是机体自身的组织,天然生物材料经过亿万年的演变进化,形成具有结构复杂精巧、效能奇妙多彩的功能原理和作用机制。新鲜自体骨是由无机材料和有机材料巧妙地结合在一起形成的复合体,其中无机材料的大部分是羟基磷灰石结晶,具有较高的骨诱导性,无免疫排斥反应,但是会增加手术创伤,并且病人还会出现局部疼痛、感觉异常或过敏等并发症,骨的来源也十分有限。近年来,利用组织工程化骨修复骨缺损,不仅提供了一种修复骨缺损的方法,而且也提供了一种全新思路,骨组织工程学的研究为治疗骨缺损带来了新的希望。目前,体外构建的组织工程化人工骨虽然还停留在实验室及动物实验阶段,但随着细胞生物学、工程学、免疫学、材料学等相关学科的发展,骨组织工程学的研究也将会取得突破性进展,在工业化生产和临床应用上有着极其广阔的应用前景,它将会成为21世纪极具发展潜力的高新技术产业,蕴藏着巨大的经济与社会效益。作为人类骨组织的主要无机成分,羟基磷灰石生物陶瓷价廉易得,具有良好的生物相容性,可降解又具备骨引导、骨融合性,尤其是含孔的珊瑚羟基磷灰石可提供很大的表面积/体积比,能保证细胞的增殖、分化和高代谢活动,所以特别适合用于骨组织工程。随着现代工业化机械化程度的提高,由于创伤、感染、肿瘤、事故、战争、地震等所致的大量污染性骨缺损发生率大幅度升高。对其传统治疗方法,即先清创、待伤口关闭、无感染迹象3-6个月后、再行二期植骨修复；而一期植骨常因发生较高的感染率而被视为禁忌,且临床上细菌耐药性的问题日益严重,植骨材料加载抗生素的作用越来越局限化,对抗菌剂提出了更高的要求。为解决传统治疗方法所带来的增加治疗时间、难度、患者的痛苦和经济负担等一系列问题,改变传统观念,近年来,国内外学者在抗菌骨移植材料的基础实验和临床实践方面进行了大量的研究,取得了一定的进展。为此,我们研制一种抗菌性骨支架修复材料,并经以下系列实验研究证明：这一抗菌性骨修复材料具有良好的生物相容性,可在局部缓释银离子,有效地抑制污染性骨缺损清创术后局部残留的细菌。实验分四个部分进行观察研究：课题研究第一部分：载银珊瑚羟基磷灰石人工骨的制备及性能表征。目的：制备载银珊瑚羟基磷灰石人工骨并观察其理化性能表征。方法：实验于2008-05/08在清华大学材料科学与工程系实验室完成。实验材料：在加工好的珊瑚羟基磷灰石(Coral Hydroxyapatite, CHA)颗粒与相应浓度硝酸银(Silver nitrate, AgNO3)溶液浸泡一定时间后置入冻干机冻干制得载银珊瑚羟基磷灰石(Silver-loaded Coral Hydroxyapatite, SLCHA或Ag+-CHA)。应用X射线衍射法对Ag+-CHA、CHA和纯珊瑚样品晶体的物相、结构和位相进行分析；应用FT-IR光谱法对样品的材料组成进行分析；应用扫描电镜观察材料的显微形貌和孔径；利用压缩试验及三点弯曲试验评价骨修复支架材料的机械性能。应用SPSS13.0软件对机械性能测试结果行单向方差分析及LSD法两两比较(a=0.05)。结果：①X射线衍射法对Ag+-CHA、CHA和纯珊瑚三种材料晶体进行物相分析、结构分析和位相分析,图形显示Ag+-CHA样品的衍射峰与CHA的图谱基本相符,而且XRD图中无其他相的衍射峰,说明银离子与CHA发生反应后产物比较单一,无其他衍生物生成,仍然保持原有的晶形结构；同时晶面位于(211),(300)的峰值较CHA低,说明银离子可能与此晶面位置的HA发生反应。②FT-IR光谱法图中显示三者具有一定的相似性,1456 cm-1和1413cm-1是材料中C032-基团的特征峰位,与纯珊瑚基本一致,说明Ag+-CHA和CHA材料本身大部分为CaCO3成分。1031 cm-1、604 cm-1和563cm-1为HA的特征峰,即显示出P04-3离子根的振动峰,说明Ag+-CHA和CHA中已存在一部分HA。这些HA特征波峰变宽,对FT-IR光谱进行分析,Ag+-CHA的曲线的变化可能与Ag+与CHA的Ca2+之间存在离子键变换、Ag+的离子半径大于Ca2+有关。③扫描电镜、能谱分析及背散射电镜可见载银珊瑚羟基磷灰石样品仍维持着珊瑚本身的三维多孔结构,载银材料表面存在有钙、碳、银、磷和氧等多种元素,且载银材料表面沉淀物的银含量与制备过程中硝酸银的浓度成正比关系；④采用压缩试验法分析这三种材料间的压缩强度无显著性差异(F=3.147,P=0.196)；三种材料间的压缩模量无显著性差异(F=0.827,P=0.482)；及采用三点弯曲试验法分析三种材料间的三点弯曲折断功无显著性差异(F=2.543,P=0.159)。结论：珊瑚羟基磷灰石经载银后未改变其理化性能,依然维持着三维多孔框架结构；制备原理主要为钙银离子之间的置换反应,其次为银离子的溶出-沉积反应,并且随着制备过程中硝酸银溶液浓度的递增,Ag+-CHA的载银量也随之递增。课题研究第二部分：载银珊瑚羟基磷灰石人工骨的载银量及体外缓释实验研究目的：研制载银珊瑚羟基磷灰石抗菌性人工骨支架材料,通过对其自身载银量及体外缓释实验完善对该抗菌性磷灰石类复合人工骨的认识。方法：应用电感耦合等离子体发射光谱(inductively coupled plasma optical emission spectrometry, ICP-OES)测定载银材料中银的平均含量,并在模拟体液(Stimulated body fluid, SBF, pH=7.25)中通过体外释放试验测定银离子释放浓度与时间的变化曲线,探讨材料结构与释放银的关联性。实验数据应用SPSS13.0统计软件处理,用相关回归分析和曲线拟合载银量与AgNO3浓度关系曲线,建立回归方程。结果：根据实验结果绘制的载银量-AgNO3浓度关系曲线。经统计学分析拟合出载银量-AgNO3浓度曲线方程为：y=3E+007x2+126863.3x+12.845(R SquareChange=0.997),对方程进行回归检验,F=959.625,P=-0.000,有统计学意义。载银羟基磷灰石颗粒3个试样中银离子均能从颗粒向模拟体液中扩散,具有明显缓释作用。第1个24小时释放量最大,达到885.27±122.49μg/L,低于文献中报道的银离子最低抑菌浓度(MIC) 1.25μg/mL.,达到减毒增效的效果。以后逐渐减少,7-14天维持一平台期释放,其后以较低浓度维持,第28天仍有79.80±6.69μg/L的银离子释放量。结论：载银珊瑚羟基磷灰石之所以能保持长时间的银离子释放,与羟基磷灰石本身的空间晶格结构关系密切,这种可逆的离子置换过程使其释放性能更显著,能更有效地避免银离子突释,保持长时间的持续释放,有效地减少金属银的使用量,达到减毒增效的作用。课题研究第三部分：载银珊瑚羟基磷灰石人工骨的细胞相容性研究目的：研制载银珊瑚羟基磷灰石抗菌性人工骨支架材料,观察其在体外与小鼠胚胎成骨细胞株(MC3T3-E1)的细胞相容性。方法：实验于2009-06/09在广州军区广州总医院实验科完成。采用体外细胞培养技术,将MC3T3-E1细胞种植于10-3、8×10-5、10-5mol/L Ag+-CHA, CHA及纯珊瑚支架材料上。实验评估：①MTT法测定MC3T3-E1细胞接种在不同支架材料上生长1,3,5d后的吸光光度值,绘制细胞在不同骨材料上的生长曲线,评价材料上细胞的增殖情况；②碱性磷酸酶(ALP)活性法测定细胞接种在不同支架材料上2,4,6d的吸光光度值,计算培养液中碱性磷酸酶值；③倒置相差显微镜下直接观察培养板上MC3T3-E1细胞的生长形貌；④应用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscopes, CLSM)直接观察支架材料上MC3T3-E1细胞的生长形貌；⑤应用扫描电镜(SEM)观察细胞在材料上生长的微观形貌。应用SPSS 13.0软件对各框架材料上的细胞生长情况结果行析因方差分析及LSD法两两比较,(α=0.05)。结果：①成骨细胞在各组材料上的增殖能力有显著性差异(F=76.457,P=0.000)。CHA组与8×10-5mol/L组比较有显著性差异(P=0.019),而与10-5mol/L组及纯珊瑚组两两比较均无显著性差异(P值分别为0.177、0.428),成骨细胞在CHA组上的活性最高,增殖能力最强,增长速度最快,其次为纯珊瑚组、10-5mol/L组及8×10-5mol/L组；而细胞在10-3mol/L组上的增殖能力最低,材料上细胞数目最少,与其他组比较均有显著性差异(P值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000),各组与对照组相比较均有显著性差异(P值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000),表明8×10-5、10-5mol/L Ag+-CHA及其他非载银材料适合用于培养成骨细胞,对细胞无明显毒性,可诱导细胞迅速增长,而10-3mol/L Ag+-CHA不适合成骨细胞在其上生长。②各组之间比较有显著性差异(F=15.582,P=0.000)；10-3mol/L组与其他各组之间比较有显著性差异(P值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000),说明细胞在此组材料上生长最慢,分泌ALP最少；8×10-5mol/L组与对照组比较无显著性差异(P值为0.292),而8×10-5mol/L组与10-5mol/L组及CHA组两两比较无显著性差异(P值分别为0.340、0.068),说明随着材料载银量的减少,上述载银材料对细胞已无明显毒性作用；10-5mol/L组、CHA组、纯珊瑚组三组之间比较无显著性差异(P值分别为0.366、0.292、0.880),而与对照组比较有显著性差异(P值分别为0.049、0.006、0.004),说明三组材料适合细胞在其表面粘附生长,同时材料的三维多孔空间结构拓展了细胞粘附的表面积,有利于细胞快速增殖,其结果与MTT试验结果一致。③MC3T3-E1细胞与不同框架材料联合培养1d时的生长形貌：10-3mol/L Ag+-CHA培养板上细胞未贴壁生长,为透明的圆球形,呈游离状态,未能很好舒展,且有些皱缩,生长活力也不旺盛；细胞与8×10-5mol/L组、10-5mol/L组、CHA组及纯珊瑚组联合培养的生长情况要明显好于10-3mol/L组,细胞相互融合成片,多呈长梭形,细胞紧密排列成束,聚集生长的趋势更明显,这些结果与MTT及ALP结果相一致。④CLSM图像显示三组材料上的细胞数量及形貌无明显差别。⑤SEM图像显示材料上细胞呈梭形,较扁平,表面有细小绒毛与皱褶,细胞在与材料接触部位伸出伪足,形成鸭蹼状粘附并包绕材料,表面可见其分泌的骨基质。结论：通过MTT、ALP活性、倒置相差显微镜、激光共聚焦及扫描电镜全方位多角度观察了细胞在天然框架材料上的反应。细胞增殖、生长良好,表明材料具有良好的细胞相容性。MTT、ALP活性的定量结果表明低载银量珊瑚羟基磷灰石材料与非载银骨替代材料的生物相容性基本一致。课题研究第四部分：载银珊瑚羟基磷灰石人工骨修复兔桡骨污染性骨缺损的实验研究目的：通过体内动物实验检测该抗菌性人工骨植入动物体内的组织相容性、骨传导性和材料的生物降解等组织自愈合生物学性能。方法：新西兰大白兔36只,随机分为4组,每组9只。选用新西兰大白兔制作兔桡骨15mm节段性污染性骨与骨膜缺损模型,将36只大白兔称重,按体重大小顺序编号,按随机数目表法随机分为A-D组。A组植入载银珊瑚羟基磷灰石材料；B组植入珊瑚羟基磷灰石材料；C组植入原位自体骨材料；D组无任何植入,做为对照组。分别于术后2,6,10周分三次处死动物取材,每次每组3只,通过大体观察、影像学检查、组织学检查观察比较各组骨缺损修复情况,应用SPSS13.0软件对X线观察结果行重复测量方差分析及LSD法两两比较,α=0.05,比较上述各组对大段骨缺损的修复作用。结果：不同组材料对骨缺损修复的大体观察结果可见2w时A、B两组移植物表面有肉芽组织和部分半透明骨质覆盖,与宿主骨断端间有部分骨痂连接,移植物无明显移位；C组移植物与宿主骨有部分骨痂连接,移植物无活动；D组骨缺损区填充以肌纤维组织。6w时A、B两组移植物表面有薄层骨质覆盖,与宿主骨断端间有大量骨痂连接,较稳固；C组移植物与宿主骨皮质连续,但不均匀,移植物无明显移位；D组缺损区仍填充以肌纤维组织。10w时A、B两组移植物表面有明显连续骨质覆盖,移植物稳固；C组移植物与宿主骨皮质连续成一体；D组缺损区仍填充以肌纤维组织。X线检查结果可见不同时间点各组之间比较有显著性差异(F=11.537,P=0.000)；自体骨成骨情况最好,与其他各组之间比较有显著性差异(P值分别为0.004、0.010、0.000),说明自体骨组织在大段骨缺损修复时仍然是最好的材料；Ag+-CHA组与CHA组两组比较无显著性差异(P值分别为0.524),说明珊瑚羟基磷灰石经一定量载银后其成骨作用未受明显影响；对照组与其他各组之间比较有显著性差异(P=0.000、0.000、0.000),说明污染性兔桡骨大段骨缺损后其成骨作用明显受到抑制,其模型制作是成功的。结论：根据仿生的思路和以往对骨修复框架材料的研究,我们制备了一种新型的抗菌性框架材料用于污染性骨缺损修复。此材料成分和结构均与天然骨无机成分有相似性,多孔结构与松质骨类似。通过体内动物实验,证明了此材料具有良好的生物相容性和骨传导性,是有效的骨修复框架材料,可以达到与自体骨材料相同的效果,有希望成为污染性骨缺损修复的优选材料,具有广阔的市场前景。综上所述,抗菌性载银珊瑚羟基磷灰石骨替代材料的制备过程简单,抗菌剂银离子的缓释性能较为理想,在污染性大段骨缺损处有良好的骨传导性及成骨作用,可以预想该抗菌人工骨材料是一种治疗污染性骨缺损的良好骨修复材料。