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研究背景骨关节炎(Ostearthritis OA)是我国四大老年病之一,严重影响老年患者的日常生活,但OA的发病机制至今尚未明确。目前研究资料显示,OA的致病过程中受多种基因的调控,涉及多种分子,并形成网络级联系统,形成恶性循环,从而导致软骨细胞集聚、软骨基质降解及软骨细胞的凋亡等。通过免疫组化研究显示,人OA软骨细胞较之正常软骨细胞呈高表达基质金属蛋白酶(MMPs)、白细胞介素类(ILs)及生长类等细胞因子。另外,研究证明一氧化氮(NO)是OA的致病过程中的重要介质,在OA病理过程中,可促进众多促炎因子的表达,从而打破抗炎因子与促炎因子之间的平衡,导致胞外基质的降解和软骨的破坏。在炎性因子,如IL-1β、LPS等的作用下,软骨细胞表达NO的量明显升高,并发挥其炎症介质的作用。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂可明显降低NO在软骨细胞中的表达,动物实验已经证明iNOS抑制剂可明显改善OA关节软骨破坏程度,并且在体外培养的软骨细胞中,也已经证明iNOS抑制剂可降低一些促炎因子的表达,由此,表明iNOS抑制剂具有保护关节软骨,延缓OA的病理进程的作用。由于涉及OA病理过程中的细胞因子不是通过单一的途径发挥作用的,而是彼此交错,相互影响,形成级联反应,因此对单一或少数几个分子的研究有一定的局限性。liquichip workstation液相蛋白芯片系统是一种新型的蛋白质研究平台,可以同时对同一样品中的多个不同的分子进行同时检测,横向比较这些因子间的关联性,有助于筛选出OA相关致病关键因子,并且通过检测iNOS抑制剂作用前后细胞因子的表达情况,进一步了解其在OA致病机理中的作用机制,为其在临床上的应用提供更加科学的依据。研究目的应用炎性因子IL-1β诱导正常和OA软骨细胞表达NO,并通过iNOS抑制剂—氨基胍(AG)抑制iNOS的活性,调节两种软骨细胞表达NO。应用liquichipworkstation液相蛋白芯片系统检测正常人软骨细胞和OA软骨细胞在IL-1β和(或)AG的作用下,细胞上清液中一些与OA病理过程密切相关的细胞因子(MMP-1,3,9、IL-6、TGF-β及VEGF)表达情况,从中筛选出关键性致病因子,了解NO在OA致病过程中的作用,为iNOS抑制剂在临床上的应用提供依据。研究方法1.收集正常膝关节软骨细胞(胫骨平台粉碎性骨折的游离软骨、关节软骨创伤性撕脱即行关节镜手术者及小腿软组织或骨肿瘤行膝关节截肢者)和OA软骨细胞(需关节置换者),体外两种软骨细胞培养。施以炎性因子(IL-1β)和(或)AG,检测其上清液NO表达水平,并比较两者之间的差异。2、应用liquichip workstation液相蛋白芯片系统检测IL-1β和(或)AG对两种细胞培养的上清液中MMP-1,3,9、IL-6、TGF-β及VEGF等细胞因子表达情况,比较其间细胞因子表达的差异,从中筛选出关键性致病因子,并进一步了解iNOS抑制剂在OA致病过程中的作用。3、所测数据以(?)±S表示,统计用SPSS 13.0软件,比较采用析因设计资料的方差分析及多组均数间的LSD法检验,实验组和对照组行两样本的均数比较,若是方差不齐,行两独立样本的非参数比较。P=0.05时差异有统计学意义。结果1、在体外培养正常软骨细胞和OA软骨细胞的大体形态无明显差异。OA软骨细胞在细胞贴壁及原代培养上所需时间比正常软骨细胞长。软骨细胞在传至第四代后会出现反分化现象。透射电镜显示正常软骨细胞胞体呈类圆形;胞核呈圆形或椭圆形,显色为中等,其周围可见扩张的粗面内质网;胞质内可见糖原颗粒。OA软骨细胞胞体减小,其周围有大量皱褶形成;胞核增大且显色深,呈多角形,伴有切迹形成;胞质中粗面内质网和糖原颗粒比较少见。S-100蛋白行免疫组化鉴定可见阳性细胞(加有一抗)胞质浓染,呈红褐色;阴性(不加一抗)软骨细胞内胞质着色淡。2、体外培养的单纯软骨细胞(正常软骨细胞和OA软骨细胞)上清液中,NO表达水平比较低:加入IL-1β后,表达NO的水平明显升高,并且OA软骨细胞表达NO的水平高于正常软骨细胞的表达水平;AG可以抑制IL-1β诱导软骨细胞表达NO,使表达NO的水平明显降低。3、应用liquichip workstation液相蛋白芯片系统检测6种细胞因子的表达情况,发现OA软骨细胞表达MMP-1、MMP-3、IL-6、VEGF的水平明显高于正常软骨细胞的表达水平,并IL-1β可明显诱导软骨细胞表达MMP-1、MMP-3、IL-6、VEGF的水平,但其诱导作用可被AG抑制;IL-1β和AG对OA软骨细胞和正常软骨细胞表达MMP-9的水平无明显影响:OA软骨细胞表达TGF-β的水平低于正常软骨细胞的表达水平,IL-1β可明显抑制软骨细胞表达TGF-β的水平,AG可有效阻断其对TGF-β的抑制作用。结论1、体外培养的OA软骨细胞和正常软骨细胞在大体形态上无明显差异,但通过透射电镜观察发现OA软骨细胞代谢功能减退。2.缺乏细胞因子的刺激作用下,体外培养的正常和OA软骨细胞表达NO的水平比较低:并IL-1β可诱导两种软骨细胞表达NO,这种诱导作用可被AG所抑制;IL-1β诱导OA软骨细胞的作用更加明显。3.细胞因子MMP-1、MMP-3、IL-6、VEGF等在OA的病理过程中发挥促炎的作用,可能参与关节软骨的损伤,促进OA的进展;但通过抑制NO的表达,可有效抑制上述4种促炎因子的表达,从而发挥其保护软骨的作用。NO对软骨细胞表达MMP-9的影响不明显,可能与其在关节软骨的分布具有层次性有关。TGF-β可能是OA病理发展过程中发挥一种保护性因素,通过抑制NO的表达,从而提高TGF-β在OA软骨细胞中的表达水平。4.尽管NO对涉及OA病理过程中众多细胞因子的作用是不同的,但NO是OA病理发展过程中扮演着重要的角色,如果抑制NO的表达,可以有效地延缓OA的病理进程。iNOS抑制剂可通过抑制NO的表达,可以发挥其保护软骨的作用。5.liquichip workstation液相蛋白芯片是一种高通量、高敏感性的检测系统,有助于蛋白质组学的研究。