中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹,属于甲壳纲,是我国具有经济价值的养殖品种之一,广泛分布于淡水地区。1958年,从牛松果腺的提取物中发现了褪黑激素(Melatonin,MT),又叫褪黑素。MT主要由动物松果腺分泌的一种激素,被认为是调节哺乳动物季节性繁殖的主要影响因子。在进化过程中MT被保存下来,说明MT有其独特之处。MT在甲壳纲动物的血糖稳态以及促进蜕皮和附肢再生中发挥着重要的调节作用,甚至可以通过影响X器官-窦腺复合体中激素的释放,从而影响卵巢发育和成熟,而MT大多是通过褪黑素受体(Melatonin receptors,MTR)实现其功能的。但是MT与MTR是如何实现这些变化的许多分子机制需要进一步的明确。最近,有人发现在雄性河蟹性腺的发育的过程中MTR基因表达显著下调,说明MTR参与了河蟹性腺的发育,而MTR在雄性河蟹生殖细胞中的分布特征及在生殖方面的功能还不清楚。本论文通过制备其相应的抗体进行免疫定位,分析MTR在河蟹生殖细胞和顶体反应过程中的分布特征以及MT和MTR对精子顶体反应的影响和可能存在的作用机制,为进一步分析MT和MTR的作用及为顶体反应的分子机制提供理论依据。该实验首先对本实验室已有的河蟹精巢转录组数据库进行生物信息学分析,确定了制备多克隆抗体的免疫原序列,利用聚合酶链式反应得到的免疫原的基因序列。将带酶切位点的MTR的基因片段用Nde I和Xho I酶进行酶切,同样用这两种酶对载体pET-21b进行酶切,酶切后,利用连接酶将两者进行连接,获得含有MTR基因片段的重组质粒,通过转化进入到感受态细胞BL21(DE3)中,得到可以大量表达河蟹MTR蛋白的工程菌株。原核表达的MTR重组蛋白以包涵体形式存在,该包涵体是由尿素溶解的,并利用载体上的组氨酸与镍柱的亲和特性来纯化得到MTR免疫原蛋白,然后对小鼠进行免疫,根据间接ELISA法来检测MTR抗血清的效价。利用免疫印记实验验证获得的MTR多克隆抗体能够有效的与其抗原结合。应用免疫荧光技术,对河蟹的生殖细胞中的MTR进行定位分析。利用伊红染色观察精子,将提取的河蟹的新鲜精子分成4组,(1)对照组,用DMSO处理;(2)用MT处理;(3)用MT和MTR抗血清;(4)用MT和阴性血清处理,并统计计算精子的顶体反应率。实验结果显示:在精子发生过程中MTR一直存在,在河蟹的精原细胞和精母细胞中,MTR均匀的分布在其质膜上,在精细胞及中期精细胞中,MTR在质膜上的分布不均匀,但是在精子时期,MTR定位于精子的顶体管膜上,并且在顶体反应过程中,MTR一直存在;在统计精子顶体反应率中,DMSO组与MT处理组间、MT处理组与MT和MTR抗血清处理组间均有极显著性差异;DMSO组与加入10μM的MT和阴性血清两组间存在极显著性差异,而MT处理组与MT和阴性血清处理组间没有差异。这说明MTR对河蟹精子的顶体反应有作用,并且MTR可能是通过与MT结合促进精子的顶体反应。