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目的探讨糖肽类抗生素万古霉素或达托霉素联合多黏菌素对泛耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性;初步建立鲍曼不动杆菌大蜡螟幼虫感染模型,并采用该模型评估糖肽类与多黏菌素联合的体内抗菌作用,为临床以多黏菌素为基础的抗菌药物联合治疗鲍曼不动杆菌感染奠定理论基础;通过体外和大蜡螟幼虫体内实验比较多黏菌素耐药株与敏感株在生长速率、体内毒力以及生长竞争能力方面的差别,探讨鲍曼不动杆菌对多黏菌素产生耐药是否存在生物学代价。材料与方法菌株来源主要包括6株鲍曼不动杆菌,其中1株为鲍曼不动杆菌标准株ATCC 19606,2株为多黏菌素敏感株,分离于2012~2013年度安徽地区住院患者的临床标本;其余3株均为上述3株多黏菌素敏感株在体外筛选获得的耐药株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922和铜绿假单胞菌ATCC 27853,均由安徽省细菌耐药监控中心保存。方法1.以ATCC19606与临床分离的2株(GN2231与GN0653)对多黏菌素敏感的鲍曼不动杆菌为母株,采用体外连续培养法筛选多黏菌素耐药突变株;根据美国临床实验室标准化委员会推荐的肉汤稀释法测定6株鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的最低抑菌浓度;聚合酶链反应法检测6株待测菌的碳青霉烯类和多黏菌素的耐药基因;异质性菌群谱分析法检测3株对多黏菌素敏感的菌株是否包含异质性耐药亚群;采用棋盘法、时间-杀菌曲线实验、防耐药突变浓度测定及生物膜抑制实验评估多黏菌素联合糖肽类抗生素万古霉素或达托霉素的体外联合抗菌活性。2.通过腹足注射不同数量级浓度的活菌菌液至大蜡螟幼虫体内,检测ATCC19606与GN2231的细菌毒力以及不同浓度的菌液导致的幼虫死亡率差异;注射热力致死菌株检测死亡细菌菌体对幼虫生存率影响;将注射同样菌液浓度的幼虫置于不同温度的孵育环境,检测环境温度对幼虫死亡率的影响;模拟人体给药剂量给予幼虫体内注射5种抗菌药物(头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、庆大霉素和左氧氟沙星),检测抗菌药物对幼虫感染的保护作用,并绘制出经不同抗菌药物治疗后的生存曲线,了解抗菌药物体外药敏与幼虫体内疗效的一致性;通过给药后幼虫体内血淋巴细菌负荷测定,证实体外敏感的抗菌药物在幼虫体内是否可以发挥抗菌作用,降低虫体内细菌负荷。经过以上检测初步建立鲍曼不动杆菌大蜡螟幼虫感染模型。3.采用大蜡螟幼虫感染模型测定上述6株菌的毒力及致死剂量;根据6株菌的致死剂量注射入幼虫体内,2小时内给予模拟人体给药剂量的多黏菌素单药以及分别联合万古霉素或达托霉素,每24小时观察记录幼虫死亡数量至96小时,绘制生存曲线图,分析不同给药方式的大蜡螟幼虫存活率;以致死剂量的泛耐药鲍曼不动杆菌临床株GN2231感染大蜡螟幼虫,分别于感染前和感染后2小时给予幼虫1mg/kg、10mg/kg和20mg/kg三个浓度梯度的万古霉素进行治疗,每24小时观察记录幼虫死亡数量至96小时,绘制生存曲线图,分析不同给药剂量的万古霉素对幼虫的保护作用。4.采用体外竞争实验及生长速率测定法,涂板法计算敏感菌和耐药菌在0、4、8、12、24、和48h时间点的菌落数,并计算体外竞争指数绘制竞争性生长折线图,比较多黏菌素敏感株与对应的耐药突变株在单独生长及等浓度混合生长时生长能力的差别;采用大蜡螟幼虫模型,每只幼虫均注射等量的每对敏感菌和耐药菌的混合菌液,在0、4、8、12和24h时间点,随机挑选5只大蜡螟幼虫研磨,涂板计数幼虫血淋巴内菌落数,计算各时间点的虫体总细菌负荷,并计算体内竞争指数绘制竞争性生长折线图;采用同样的方法,测定每对敏感菌与耐药菌单独在幼虫体内的生长速率,绘制生长速率折线图,分析每对敏感株及耐药株体内生长竞争和生长速率的差别。结果1.ATCC 19606除对糖肽类抗生素外均表现为敏感;GN2231和GN0653除对替加环素和多黏菌素敏感外,对其他的抗菌药物均表现为耐药;19606R、GN2231R和GN0653R对多黏菌素的MIC分别为8 mg/L、32 mg/L和16 mg/L。6株鲍曼不动杆菌均携带OXA-51基因,除19606和19606耐药突变株之外,其余4株菌同时携带OXA-23和OXA-51基因,19606R pmr B基因突变导致氨基酸置换(Ala227Val);3株多黏菌素敏感菌均检测出异质性耐药亚群;体外联合药敏实验、MPC实验与生物膜抑制实验中,多黏菌素与万古霉素或达托霉素联合均表现出较强的协同效应;杀菌曲线实验中,达托霉素与万古霉素单药对6株鲍曼不动杆菌均无杀菌活性,2种联合对多黏菌素敏感株展现出较强的协同杀菌效应,且万古霉素-多黏菌素联合对19606与GN2231的耐药突变株亦表现出协同杀菌效应。2.鲍曼不动杆菌对大蜡螟幼虫的致死能力表现出菌液浓度依赖性,且不同菌株的致死剂量不同,反映出各菌株之间不同的毒力;热力致死菌株不能够导致幼虫死亡,对生存曲线没有影响;幼虫感染后死亡率与孵育温度有一定的相关性,同样浓度的菌液注射幼虫后,在37°C孵育温度的环境中,比25°C时死亡率更高;幼虫感染后,抗菌药物单药的治疗效果与体外药敏结果具有一致性,且与虫体血淋巴细菌负荷量呈一定的相关性,敏感的抗菌药物可以降低幼虫体内细菌负荷。3.多黏菌素单药对多黏菌素敏感株感染的幼虫有较好的保护作用,尤其是ATCC19606;而对多黏菌素耐药株感染的幼虫,经多黏菌素单药治疗后生存率并不高;万古霉素-多黏菌素联用对幼虫的治疗作用大于任何一种单药的作用;达托霉素单药对感染的幼虫几乎无作用,但达托霉素与多黏菌素联合使用可提高多黏菌素敏感株感染的幼虫的生存率,且其生存率高于单一用药;此外,万古霉素单药治疗鲍曼不动杆菌感染的幼虫时,对幼虫有保护作用,可提高幼虫的生存率,且这种保护作用呈现出剂量依赖效应;而达托霉素则未表现出同样的保护作用。4.3株多黏菌素耐药突变株对除多黏菌素外其他测试抗菌药物的敏感性较敏感亲本株有明显升高;所有菌株均能够形成生物膜,但3株多黏菌素耐药株的生物膜形成能力远小于其敏感亲本株;大蜡螟幼虫实验中,19606耐药突变株的毒力小于19606;体内外生长与竞争实验中,19606的生长竞争能力大于19606耐药突变株,以上结果表明多黏菌素敏感菌19606发生耐药突变后,存在生物学代价,但GN2231与GN0653对多黏菌素耐药后,未表现出相应的生物学代价。结论1.多黏菌素与万古霉素或达托霉素联合对泛耐药鲍曼不动杆菌有体外协同抗菌活性,并能够抑制细菌生物膜形成与降低多黏菌素的防耐药突变浓度。体外对多黏菌素保持敏感的鲍曼不动杆菌中存在异质性耐药亚群是导致多黏菌素单药杀菌时再生长的原因之一。2.通过虫体内注射最低致死剂量的鲍曼不动杆菌成功建立了大蜡螟幼虫感染模型,该模型为研究鲍曼不动杆菌的体内毒力和抗菌药物活性提供了一种较为可靠的动物模型。3.在感染的大蜡螟幼虫体内,多黏菌素联合万古霉素或达托霉素较多黏菌素单药有更好的疗效,与体外联合实验一致。在体外对鲍曼不动杆菌无任何抗菌活性的万古霉素单药对感染的大蜡螟幼虫具有较好的疗效,且存在剂量-效应关系。4.多黏菌素耐药鲍曼不动杆菌可能存在生物学代价,主要表现为耐药突变株对大蜡螟幼虫的毒力减弱,以及体内外生长迟缓和生长竞争力下降。