背景:骨肉瘤是一种恶性度很高的肿瘤。免疫治疗对于预防肿瘤形成以及清除荷瘤宿主体内的残留病灶,具有较好的应用前景,而建立肿瘤免疫治疗及制备骨肉瘤疫苗的一个重要前提就是要有可作为靶向的肿瘤抗原。目前已发现的能够引起特异性免疫反应的骨肉瘤抗原在动物实验及体外诱导骨肉瘤特异性CTL的产生中显示出了良好的作用。但总的来说,疫苗效果仍不理想,其原因之一在于目前发现的肿瘤抗原的免疫原性较弱,这是限制疫苗疗法进一步发展的主要问题。这就迫切需要我们识别更多的、免疫原性更强的肿瘤抗原,致力于多价疫苗的开发,推动骨肉瘤特异性主动免疫治疗的进一步研究。目的:①构建人骨肉瘤细胞cDNA表达文库;②采用骨肉瘤患者的混合血清对9901细胞cDNA表达文库进行免疫筛选,以得到可引起免疫应答的骨肉瘤肿瘤相关抗原;③通过生物信息学分析,比较筛选得到的阳性克隆,获取具有应用价值的独立知识产权的新基因,为本课题的进一步研究确定方向。方法:①提取9901细胞总RNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,消平cDNA末端,连接EcoRⅠ适配子,磷酸化EcoRⅠ适配子5’端;Sephacryl-S400柱除去小于400bp cDNA片段,与噬菌体λgt11(载体)连接,用包装蛋白体外包装后建成初级cDNA文库;取适量包装体系倍比稀释后感染E.coli Y1090,测定文库大小及重组率;随机挑取10个噬斑,在ExAssist辅助性噬菌体的作用下,释放出PBK-CMV噬菌粒;感染大肠杆菌XLOLR,铺于卡那霉素抗性的LB平板;挑取克隆,37℃震摇过夜;提取质粒,经EcoR I和Xho I酶切后,初步确定片段的大小及多样性。②感染有重组λgt11噬菌体的大肠杆菌XL1-Blue MRF’铺于150mm NZY平板,37℃倒置培养6h后,将IPTG预先处理的硝酸纤维素膜覆盖于平板上,继续培养10h,做好标记;取下硝酸纤维素膜,用封闭液室温封闭1h后,置于1:100稀释的骨肉瘤患者血清(预先用大肠杆菌裂解物吸收)中孵育15h,再置于1:2500稀释的生物素化二抗中孵育1h,然后与1:2500稀释的碱性磷酸酶标记的亲合素孵育1h;采用NBT/BCIP对阳性噬斑显色;挑取阳性噬菌斑,再经3轮复筛,直至得到一致的阳性噬斑。③获得的阳性噬菌体克隆,在ExAssist辅助性噬菌体的作用下,在大肠杆菌XL1-Blue MRF’中剪切后,转变为PBK-CMV噬菌粒,感染大肠杆菌XLOLR后,铺于卡那霉素抗性的LB平板;挑取克隆,37℃震摇过夜;抽提质粒,经EcoR I和Xho I酶切后,初步确定片段的大小,然后测序。④采用BLAST软件进行序列同源性分析;采用Grail、ProtParam、ScanProsite、SOPMA、TMpred、SignalP、Psort、HLA_Bind等软件分析阳性克隆的编码区、功能位点、二级结构、特殊结构、细胞定位及抗原决定簇情况等,为进一步的功能研究奠定基础。结果:经计算,所建文库共含噬菌体1.5×106个;蓝白筛选平板上的242个噬斑均为白色噬斑,因此重组率在94.3%以上;通过酶切对插入片段大小进行鉴定,电泳结果显示:10个噬斑均切出插入片段,且大小不一,平均大小1.4kb左右。②第一轮筛选共得到阳性噬斑131个,再经过3轮复筛,最终得到32个阳性重组噬菌体,经剪切、感染及酶切鉴定后,全部送去测序;③测序结果经BLAST,共得到12条基因序列,其中已知基因5条,新基因7条,已全部登陆GenBank;④通过CrELISA测定新基因与患者血清反应的特异性,结果表明,OSAA-3和OSAA-5具有较高的OD值,免疫原性明显强于其他抗原。结论:①成功构建了人骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库;经鉴定,其库容量高达1.5×106,重组率大于94.3%,具有较好的多样性;②对SEREX法加以改良:采用患者混合血清进行筛库,使阳性克隆的得率增加,降低筛库的风险;采用细胞系建库,使文库更具有代表性,同时正常细胞及B细胞的干扰,减少假阳性信号的产生。③阳性克隆测序后经同源序列比对分析,共获得已知基因5条,新基因7条;④通过生物信息学和酶联免疫检测分析,我们对OSAA-3和OSAA-5的理化性质和基本功能有了初步的了解,认识到它们作为骨肉瘤相关抗原免疫原性较强,可能在细胞的生长、增殖和分化中具有重要作用。