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实验背景:肝细胞癌是肝脏中最常见的原发性恶性肿瘤,肝细胞癌是世界第六大恶性肿瘤,致死率在所有癌症死亡原因中排名第三位。在导致男性癌症方面致死率排名第五,在女性癌症致死率中排名第六,且超过一半的新病例和死亡病例发生在中国,虽然通过外科手术可显著提高早期肝癌患者的存活率,但由于肝癌的高转移性,患者的预后情况仍不容乐观。近年来有多篇文章报道DKK1的过表达与多种癌症转移相关,经前期研究发现DKK1在肝癌组织中是过表达的,且这种异常表达能够促进肝癌转移,但是到目前为止,肝癌中DKK1上调的分子机制仍不清楚,因而阐明DKK1上调的分子机制将有可能为肝癌的治疗提供潜在的作用靶点。有研究显示表皮生长因子受体EGFR在肝癌组织中的表达明显上调,且异常激活的EGFR与肝癌细胞的转移呈正相关,因而本研究提出科学假说:肝癌细胞中DKK1的异常表达很可能是因为EGFR的激活所介导的。如果EGFR介导了DKK1的异常表达,其作用机制又是什么?这是本课题所要解决的科学问题。实验方法:首先本研究利用了Western blot和Real time PCR实验检测在表皮生长因子EGF诱导下人源肝癌细胞Hep G2和SMMC-7721中DKK1蛋白和m RNA的表达情况;并在EGFR酪氨酸激酶抑制剂Gefitinib和ERK抑制剂PD98059预处理肝癌细胞1小时后加入EGF诱导,检测DKK1蛋白和m RNA的表达情况;利用Western blot实验检测在EGF诱导情况下p-ERK、p-PKM2、PKM2、p-H3 Histone、H3 Histone等蛋白的表达情况;并同时采用immunofluorescence实验检测DKK1蛋白、PKM2蛋白在肝癌细胞中的定位情况;采用Transwell小室和Matrigel基质胶实验,检测肝癌细胞在EGF诱导下的转移和侵袭情况;利用Co-immunoprecipitation实验检测EGF诱导下PKM2与ERK1/2、PKM2与H3蛋白之间的相互作用;采用免疫组化检测DEN诱导的大鼠肝癌组织中DKK1、H3蛋白的表达情况;采用ELISA实验方法检测大鼠血清中DKK1、EGF因子的含量;采用蛋白质印迹法检测大鼠肝癌组织中p-PKM2、p-H3、DKK1蛋白的表达情况。实验结果:1.Western blot和Real time PCR实验表明表皮生长因子EGF激活EGFR后可以上调DKK1蛋白和m RNA的表达。2.通过Transwell小室实验可知EGF可以促进肝癌细胞的迁移。3.EGF诱导肝癌细胞后,Western blot实验表明p-ERK1/2的表达明显上调,而EGFR抑制剂Gefitinib和ERK1/2抑制剂PD98059明显逆转EGF诱导的p-ERK1/2以及DKK1的上调。Transwell小室实验和Matrigel基质胶实验检测到EGF能够促进肝癌细胞的迁移和侵袭,并且同样使用上述抑制剂能够逆转肝癌细胞迁移和侵袭。4.EGF刺激下,p-PKM2表达明显上调;Co-IP实验验证了EGF孵育肝癌细胞后,PKM2与组蛋白H3可发生相互作用;采用Western blot实验和免疫荧光核定位实验共同验证了EGF能够诱导PKM2转位入核,当使用Gefitinib和PD98059预处理后,PKM2入核明显减少。5.成功建立DEN诱导的大鼠肝癌模型,16周后处死发现DEN诱导的大鼠肝脏组织出现明显且均匀的肿瘤结节。并通过HE染色,发现DEN诱导的肝脏组织出现明显的肝癌特征。6.Western blot、Realtime PCR实验检测大鼠肝癌组织中DKK1蛋白和DKK1m RNA表达明显高于阴性对照组。7.ELISA实验检测DEN诱导的肝癌大鼠血清中EGF和DKK1的含量明显高于对照组。8.Western blot实验发现p-PKM2和p-H3蛋白在大鼠肝癌组织中呈现出明显的高表达。9.免疫组化实验检测p-PKM2和p-H3蛋白在大鼠肝癌组织和临床样本中呈现出明显的高表达;实验结论:1.肝癌细胞中EGFR的激活可促进DKK1的转录;2.EGFR下游的ERK1/2通路可磷酸化PKM2,促进其核转位,进而引起DKK1的转录。3.PKM2依赖性的组蛋白H3的磷酸化促进了EGF介导的DKK1的转录。