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CRISPR技术是近年来最为热门的基因编辑技术,其中Cas9/sgRNA系统被广泛应用于基因编辑和调控,但在核酸检测方面的应用尚未充分发掘。Cas9/sgRNA对特异序列DNA具有很强的切割能力,能够区分单碱基错配的序列DNA,具有很好的检测和分型的潜力。目前所报道的基于Cas9的核酸检测方法中未见直接以DNA为靶标的检测和分型技术。为充分开发Cas9/sgRNA系统在检测核酸方面的应用潜能,本研究使用Cas9/sgRNA系统分别在体内和体外对HPV DNA进行检测和分型。本研究中,首先针对四种HPV(低危型:HPV6,HPV11;高危型:HPV16,HPV18)各设计三个sgRNA探针,然后分别构建了靶向不同HPV DNA的Cas9载体,导入相应的HPV感受态细胞后,在启动子J23100和启动子J23119的控制下,分别表达Cas9蛋白和sgRNA。形成的Cas9/sgRNA复合物,通过对靶序列进行特异切割影响细菌生长。细菌生长状况表明,所设计的sgRNA能够特异性靶向目的DNA,引导Cas9蛋白进行正确地切割,Cas9/sgRNA系统可以用于HPV的检测和分型。为了探究Cas9/sgRNA系统在体外的切割效果,通过体外转录的方式制备sgRNA,与Cas9蛋白组装,在体外对pHPV质粒进行切割。结果表明pHPV质粒被成功切割成预期大小的片段,证明Cas9/sgRNA系统能够在体外特异切割目的DNA。另外,为了提高检测的灵敏度,建立了基于CRISPR或Cas9/sgRNA的分型PCR(CRISPR or Cas9/sgRNA-typing PCR,ctPCR)来检测HPV DNA。该方法主要分为三步:(1)用一对通用引物扩增出目的DNA,即PCR1;(2)用CAT处理PCR1的扩增产物(C:Cas9切割;A:末端加A;T:T adaptor连接);(3)用特异引物扩增CAT处理后的产物,即PCR2。该方法从11种HPV质粒中区分出HPV16和HPV18,并且通过检测L1和E6E7两个区域,从SiHa细胞和HeLa细胞基因组DNA中分别检出HPV16和HPV18。另外,通过浓度梯度实验检测,该方法通过0.005 ng HeLa基因组DNA作为qPCR1起始模板即可判断是否含有目的片段。10000倍稀释qPCR2的模板,仍可以对目的片段进行分型。最后,运用该方法对八个临床样品进行实际检测。由qPCR1结果显示,两个样品为HPV阳性,其余六个为HPV阴性,经过CAT处理和qPCR2,对两个阳性HPV样品分型,两样本分别为HPV16和HPV18感染。本研究建立的ctPCR法可以成功地检测和分型HPV DNA,其中PCR1的目的是检测样品是否感染HPV,PCR2则将PCR1中确认感染HPV的样品进行分型。该研究为基于CRISPR技术的核酸检测与分型提供了新的思路和方法。