灰霉病是保护地栽培中常见的一种真菌病害,可以危害作物的花果、叶片和茎,给农业生产带来严重的产量和品质损失。化学防治是控制该病的主要手段,但由于灰霉病菌繁殖能力强、寄主范围广和易变异等特点,目前已对多种防治药剂产生了抗性。在山东省,琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI）类的啶酰菌胺和甾醇脱甲基化酶抑制剂（DMI）类的啶菌噁唑是防治灰霉病的两种常用杀菌剂,本文系统监测了近年来该地区灰霉病菌对两种药剂的敏感状况变化,检测了抗性菌株的突变类型与抗性程度变化的关系。初步评价了两种新型SDHI类杀菌剂苯并烯氟菌唑和氟唑菌酰羟胺在山东地区管理灰霉病抗性菌株的应用潜力,探讨了杀菌剂蘸花施药防治灰霉病的可行性。主要结果如下:1.2017-2019年通过菌丝生长速率法,测定了山东省283株灰霉病菌对啶菌噁唑的敏感性。结果表明不同年份的灰霉病菌对啶菌噁唑的敏感性不存在显著性差异,三年度的灰霉病菌对啶菌噁唑的平均EC₅₀值分别为0.12±0.01 mg L^-1、0.16±0.01 mg L^-1和0.13±0.02 mg L^-1。因此,啶菌噁唑对山东地区的灰霉病菌依然有很强的抑制作用,不过每年也检测到一些敏感性下降的菌株。通过对敏感性下降的菌株的CYP51基因测序、比对,发现了3株具有点突变的灰霉病菌,突变类型分别为24位的异亮氨酸替换缬氨酸（V24I）;136位苯丙氨酸替换酪氨酸（Y136F）以及464位的赖氨酸替换精氨酸（R464K）。将敏感菌株和三个突变菌株的CYP51基因构建到pPIC9K载体上,并转化毕赤酵母GS115,验证了相应转化子对啶菌噁唑的敏感性。结果表明V24I和Y136F两种突变体降低了对啶菌噁唑的敏感性,而R464K突变体与啶菌噁唑的抗性无关。本研究还发现BcCYP51、Bcmfs1和BcatrD三个基因均能在不敏感菌株中过量表达,而与多重抗性相关的BcatrB和BcmfsM2两个转运蛋白基因表达量并没有显著增加。这表明除了V24I和Y136F两种突变体以外,不敏感菌株中CYP51和部分转运蛋白基因的过量表达也可能参与对啶菌噁唑的抗性。另外,本研究也发现不敏感菌株均有能力在田间环境中生存。上述结果表明,啶菌噁唑依然可以在田间应用,但是田间已经开始出现抗性菌株,所以建议应该制订预防啶菌噁唑抗性快速发展的使用策略。2.2014-2019年采用孢子萌发法,测定了山东济南、潍坊、泰安、莱芜、聊城和临沂等地区720株灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感性。整体上,山东地区灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感性呈逐年下降趋势。2014年灰霉病菌对啶酰菌胺的平均EC₅₀值为0.3±0.02 mg L^-1,EC₅₀值范围为0.03-1.56 mg L^-1,抗性系数为52。2019年灰霉病菌对啶酰菌胺的平均EC₅₀值为6.39±1.66 mg L^-1,EC₅₀值范围为0.01-85.56 mg L^-1,抗性系数为8556。不同地区灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感性下降程度存在差异,以聊城和莱芜地区的灰霉病菌敏感性下降最明显,并且这两个地区灰霉病菌的抗性频率也是上升最快的。山东省灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性与SdhB基因的点突变有关,且存在不同类型。2014-2019年,共检测出四种类型的突变菌株,分别是在225位苯丙氨酸替换脯氨酸（P225F）,230位异亮氨酸替换天冬氨酸（N230I）,272位精氨酸或酪氨酸替换组氨酸（H272R/Y）。抗性菌株2014年所占比例为0.81%,2019年所占比例为28.97%。本研究也首次发现了SdhC基因上同时拥有四个点突变的突变体,四种点突变分别是85位的甘氨酸替换丙氨酸（G85A）,93位的缬氨酸替换异亮氨酸（I93V）,158位的缬氨酸替换甲硫氨酸（M158V）,168位的异亮氨酸替换缬氨酸（V168I）,不过这四种突变位点与灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性无关。本研究未在SdhD基因上没有发现任何点突变。3.通过孢子萌发法和菌丝生长速率法,测定2019年107株灰霉病菌对氟唑菌酰羟胺的敏感性,并利用其中74株敏感菌株建立了对氟唑菌酰羟胺的敏感基线。氟唑菌酰羟胺对菌丝平均EC₅₀值为0.07±0.009 mg L^-1,EC₅₀值范围为0.001-0.4 mg L^-1;对孢子平均EC₅₀值为0.02±0.007 mg L^-1,EC₅₀值范围为0.001-0.06 mg L^-1,符合单峰曲线,可作为氟唑菌酰羟胺对灰霉病菌的敏感基线,用于氟唑菌酰羟胺的抗性监测。P225F、N230I、H272Y和H272R四种突变体对氟唑菌酰羟胺的平均EC₅₀值分别为0.31±0.09、0.07±0.02、0.29±0.05和0.08±0.02 mg L^-1。这表明携带P225F、H272Y、N230I和H272R突变的菌株均能够不同程度降低对氟唑菌酰羟胺的敏感性。其中,P225F和H272Y两种突变体对氟唑菌酰羟胺表现为低、中水平抗性,N230I和H272R两种突变体对氟唑菌酰羟胺表现为低水平抗性。氟唑菌酰羟胺与氟吡菌酰胺、啶酰菌胺、苯并烯氟菌唑和吡唑萘菌胺均存在交互抗性,其中,氟唑菌酰羟胺与吡唑萘菌胺相关r值最大,r值为0.62。在温室试验中,氟唑菌酰羟胺在300 mg L^-1浓度下对叶片和果实的防效分别为80.9%和71.5%,明显高于啶酰菌胺在400 mg L^-1浓度下对叶片和果实分别为42.7%和48.6%的防效,因此氟唑菌酰羟胺具有替代啶酰菌胺防治灰霉病的潜力。4.2017年,来自山东不同地区的103株灰霉病菌,测定了对苯并烯氟菌唑的敏感性。苯并烯氟菌唑对菌丝平均EC₅₀值为2.15±0.19 mg L^-1,EC₅₀值范围为0.01-9.49 mg L^-1;对孢子平均EC₅₀值为0.89±0.14 mg L^-1,EC₅₀值范围为0.01-6.49 mg L^-1。苯并烯氟菌唑对灰霉病菌具有良好的保护和治疗防效,且保护作用优于治疗作用,不过苯并烯氟菌唑在黄瓜植株中传导性较差。喷雾施药时,苯并烯氟菌唑在100、200和300 mg L^-1剂量下对黄瓜叶片上的灰霉病防效分别为73.51%、81.87%和88.55%,显著高于异菌脲500 mg L^-1的防效（52.8%）。然而,在100、200和300 mg L^-1剂量下苯并烯氟菌唑对黄瓜果实灰霉病的防效分别仅为38.75%、64.54%和76.19%,与异菌脲在500 mg L^-1的防效（44.13%）无显著性差异。另外,喷雾施药后,灰霉病菌在黄瓜果实和叶片上的侵染率分别下降7.43%和12.67%,但是在茎上的侵染率上升了2.67%。苯并烯氟菌唑在20 mg L^-1剂量下蘸花施药能够有效防治黄瓜果实上的灰霉病,其防效为93.7%,显著高于异菌脲200 mg L^-1时的防效。另外,蘸花施药后,灰霉病菌在黄瓜果实、叶片和茎上的侵染率分别下降43.33%、7.34%和1.33%。因此,与常规喷雾施药相比,蘸花施药更适合防治灰霉病。5.考虑到蘸花施药的劳动成本太高,进一步研究了不同杀菌剂与植物生长调节剂混合浸果防治黄瓜灰霉病的防效和安全性。氯吡脲和清水对照浸果处理的病级显著高于咯菌腈处理的病级。咯菌腈在30 mg L^-1剂量下浸果施药能够有效防治黄瓜灰霉病,该浓度下处理的果实的平均单果重和成果率分别为170克和86.7%,且与氯吡脲单独处理相比,提高了36.7%的产量。咯菌腈在35 mg L^-1剂量下浸果施药的残留量最高,但仍低于欧盟(1.0 mg kg^-1)和日本(2.0 mg kg^-1)的最低残留限量标准。受不同地区灰霉病菌对啶酰菌胺敏感性差异原因的影响,在临沂试验点啶酰菌胺在30 mg L^-1剂量下浸果施药防效为85.03%,与在300mg L^-1剂量下喷雾的防效（82.47%）相当。而在莱芜,啶酰菌胺无论是通过浸果施药还是喷雾施药都无法有效防治黄瓜灰霉病。在40 mg L^-1剂量下浸果施药与300mg L^-1剂量下喷雾的防效分别仅为67.38%和43.11%,且莱芜试验点黄瓜的产量也明显低于临沂。