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目的:观察瑞香素(Daphnetin,DAP)对TNF-α诱导的CIA大鼠成纤维样滑膜细胞(CIA-FLS)细胞自噬及相关PI3K/AKT/m TOR信号通路的影响,以探讨DAP抑制CIA-FLS自噬发挥抗炎的可能机制。方法:1.复制并验证TNF-α诱导CIA-FLS炎症模型2.明确DAP作用TNF-α诱导CIA-FLS炎症模型的最佳剂量CCK-8法检测不同浓度的DAP(5~60μg/m L)作用CIA-FLS炎症模型48 h后滑膜细胞存活率,为后续实验进行初步筛选。3.DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS自噬和PI3K/AKT/m TOR信号通路的影响实验分组:(1)Control组(CIA-FLS);(2)Model组(CIA-FLS+TNF-α);(3)DAP组(CIA-FLS+TNF-α+DAP);(4)LY294002组(CIA-FLS+TNF-α+LY294002);(5)DAP+LY294002组(CIA-FLS+TNF-α+DAP+LY294002)3.1倒置荧光显微镜观察DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS细胞形态的影响;3.2流式细胞术检测DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS细胞周期的影响;3.3透射电子显微镜观察DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS超微结构的影响;3.4 RT-PCR检测DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS的PTEN、AKT、m TOR、BAD、Beclin-1和TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-10、IL-17、IFN-γm RNA表达水平的影响;3.5 Western Blotting检测DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS自噬蛋白Beclin-1、LC3和PI3K/AKT/m TOR信号通路蛋白PI3K、AKT、p-AKT、m TOR、p-m TOR的表达量的影响;3.6 ELISA检测DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS细胞上清中炎症因子TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-10、IL-17和IFN-γ含量的影响。结果:1.TNF-α诱导CIA-FLS炎症模型的条件为10 ng/m L,0.5 h。2.DAP(25~60μg/m L)呈剂量依赖性地抑制TNF-α诱导的CIA-FLS的增殖。DAP(30μg/m L)作用CIA-FLS的存活率接近IC50。3.DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS细胞增殖和自噬的影响3.1 DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS细胞形态的影响:Control组的CIA-FLS均匀分布,折光性好,边缘清晰;Model组的CIA-FLS数目较为增多,排列紧凑;DAP组、LY294002组和DAP+LY294002组的CIA-FLS数目明显减少,分布不均,组间形态差异不明显。3.2 DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS的细胞周期的影响:DAP组、LY294002组和DAP+LY294002组S期百分比明显低于Model组,G0/G1期百分比明显高于Model组。(P<0.001)3.3 DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS的超微结构的影响:Control组中的CIA-FLS呈圆形,包膜完整,核仁清晰,含少量自噬体;Model组的超微结构虽与Control组类似,但含自噬体数目明显增多;DAP组、LY294002组和DAP+LY294002组的CIA-FLS超微结构发生改变,自噬体数目明显减少3.4 DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS自噬蛋白LC3和Beclin-1的影响:DAP组、LY294002组和DAP+LY294002组的自噬特异性蛋白LC3和Beclin-1的表达明显低于Model组(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。3.5 DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS自噬基因Beclin-1 m RNA水平的影响:DAP组、LY294002组和DAP+LY294002组的Beclin-1 m RNA水平明显低于Model组(P<0.05或P<0.01)。4.DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS PI3K/AKT/m TOR信号通路的影响4.1 DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS PI3K/AKT/m TOR信号通路蛋白PI3K、AKT/p-AKT、m TOR/p-m TOR的影响:DAP组、LY294002组和DAP+LY294002组的PI3K,p-AKT,p-m TOR蛋白水平明显低于Model组(P<0.05,P<0.01或P<0.001);AKT/p-AKT、m TOR/p-m TOR的蛋白表达比率亦明显低于Model组(P<0.01或P<0.001)。4.2 DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS的PTEN、AKT、m TOR和BAD m RNA水平的影响:DAP组、LY294002组和DAP+LY294002组AKT m RNA相对表达量明显低于Model组,PI3K负调控基因PTEN、凋亡基因BAD和自噬负调控基因m TOR m RNA相对表达量明显低于Model组。(P<0.05)5.DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS炎症因子TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-10、IL-17和IFN-γ表达的影响5.1 DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS的TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-10、IL-17和IFN-γm RNA水平的影响:DAP组、LY294002组和DAP+LY294002组TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-17和IFN-γm RNA水平低于Model组(P<0.05,P<0.01或P<0.001),而DAP组和DAP+LY294002组IL-10 m RNA水平高于Model组(LY294002组除外)(P<0.001)。5.2 DAP对TNF-α诱导的CIA-FLS细胞上清中的TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-10、IL-17和IFN-γ含量的影响:DAP组、LY294002组和DAP+LY294002组的TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-17、IFN-γ含量低于Model组(P<0.05,P<0.01或P<0.001),而IL-10的含量仅在DAP组明显增多(P<0.05)。结论:1.TNF-α诱导CIA-FLS炎症模型的最佳条件为10 ng/m L,0.5 h。2.DAP(25~60μg/m L)呈剂量依赖性地抑制TNF-α诱导的CIA-FLS的增殖。DAP(30μg/m L)作用CIA-FLS的存活率接近IC50。3.DAP(30μg/m L)可以诱导CIA-FLS的G0/G1期阻滞来抑制细胞增殖。4.DAP(30μg/m L)可以抑制TNF-α诱导的CIA-FLS自噬的发生。5.DAP(30μg/m L)通过下调PI3K/AKT/m TOR信号通路来抑制TNF-α诱导的CIA-FLS自噬。6.DAP(30μg/m L)可通过调节炎症因子TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-10、IL-17和IFN-γ的表达来减轻炎症。综上,DAP可通过诱导CIA-FLS的G0/G1期阻滞来抑制CIA-FLS增殖;又通过下调PI3K/Akt/m TOR信号通路来抑制细胞自噬,从而减轻TNF-α诱导的CIA-FLS炎症。