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一、研究背景膀胱癌90%以上病理类型为移行细胞癌。随着人口老龄化加剧以及环境污染日益严重,膀胱癌已成为严重危害人类健康的恶性肿瘤。尽管非肌层浸润性移行细胞癌（NMIBC）为大多数患者的初诊类型,但肌层浸润性移行细胞癌（MIBC）的进展率为30%,膀胱全切术后5年生存率约为50%、10年生存率约为36%。由此可见,深入研究膀胱癌精准靶向治疗方案具有非常紧迫的现实意义。巨噬细胞（macrophages,MΦ）是固有免疫以及适应性免疫系统的主要免疫细胞,而肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）是肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中的重要组成部分,具有两种亚型:由脂多糖（LPS）和干扰素γ（IFN-y）通过STAT1和STAT3磷酸化诱导的M1型Mφ,以及由IL-4和IL-13通过STAT6磷酸化诱导的M2型Mφ。然而,TAM及其极化状态与前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen,PSMA）表达之间的关系,未发现有明确研究。因此,本研究对肿瘤相关巨噬细胞通过IL-4/STAT6通路上调膀胱癌组织新生血管中PSMA表达进行相关的研究。前列腺特异性膜抗原（PSMA）是主要表达在前列腺癌上皮细胞上的Ⅱ型跨膜糖蛋白,同样也在肾癌、甲状腺癌、乳腺癌等实体肿瘤的新生血管内皮细胞中表达,但PSMA在膀胱移行细胞癌新生血管上皮细胞中表达的研究却具有争议:Samplaski等对167例膀胱癌患者的病理切片进行研究发现,PSMA在浸润性膀胱癌组织中的表达量与肿瘤病理分型相关,但所有类型的肿瘤新生血管内皮细胞中均表达PSMA,预示PSMA与肿瘤血管生成和预后密切相关。然而,Campbell等对3例转移性膀胱癌患者进行影像学和病理学分析,PSMA在膀胱癌中低表达导致PSMAPET/CT的影像学诊断受限,但由于样本数量少且病例数量只有3例导致争议和临床不确定性。因此针对这一争议,探究PSMA在浸润性膀胱移行细胞癌中的表达及与肿瘤新生血管之间的关系,寻找PSMA抑制剂抗新生血管靶向治疗的机制,具有重要的临床意义。二、研究目的本研究应用人膀胱移行细胞癌细胞系T24与人单核巨噬细胞系THP-1作为共培养细胞模型,建立人膀胱移行细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型,收集人浸润性膀胱移行细胞癌病理标本,探讨膀胱癌表达和分泌IL-4,激活肿瘤微环境（TME）巨噬细胞中STAT6磷酸化促进其向M2型Mφ极化,M2型Mφ通过分泌内皮素4D（Sema4D）促进TME中CD31表达,导致PSMA表达增高的机制;应用PSMA抑制剂2-PMPA可以抑制肿瘤组织中CD31表达,探讨抑制膀胱移行细胞癌的生长和增殖的机制。三、材料与方法1、膀胱移行细胞癌细胞通过分泌IL-4促进STAT6磷酸化诱导巨噬细胞向M2表型极化的机制研究（1）将人单核巨噬细胞系THP-1细胞应用佛波酯（PMA）诱导为M0型Mφ,向M0型Mφ中加入重组LPS及IFN-γ诱导为M1型Mφ,向M0型Mφ中加入重组人IL-4及IL-13诱导为M2型Mφ。（2）人膀胱移行细胞癌细胞系T24与M0组、M0（+IL-4R）组、M0（+AS1517499）组共培养。（3）Western blot、实时荧光定量PCR检测M0、M1、M2型Mφ与共培养M0组、M0（+IL-4R）组、M0（+AS1517499）组中生物标志物CD80、iNOS、CD163、Arg-1、pSTAT6、Sema4D的表达。（4）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测M0、M1、M2型Mφ与共培养M0组、M0（+IL-4R）组、M0（+AS1517499）组中IL-4、Sema4D的表达。2、PSMA抑制剂2-PMPA下调CD31与Sema4D表达的裸鼠皮下移植瘤模型研究（1）应用膀胱移行细胞癌细胞系T24构建人膀胱移行细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型。并随机将10只裸鼠分为实验组（2-PMPA）和对照组,每组5只。每5日用游标卡尺测量裸鼠皮下肿瘤的最大径和用电子质量称测量裸鼠重量。在给药第30天实验结束时,颈椎脱臼处死裸鼠,剥取皮下肿瘤进行下一步实验。（2）免疫组化测量实验组和对照组肿瘤中PSMA、CD31、Sema4D、Plexin-B1的表达量。（3）免疫荧光双标法测量实验组和对照组肿瘤中CD163与Sema4D、CD31与PSMA的表达量。3、PSMA与CD31表达在膀胱移行细胞癌分期和预后中的临床研究（1）收集行根治性膀胱全切除术治疗的原发性膀胱移行细胞癌的患者37例。收集患者的年龄、CTU、泌尿系超声、膀胱镜检查、肿瘤大小、病理分级、TNM分期及所用化疗药物等临床资料,收集患者肿瘤组织和癌旁正常组织的空白病理标本和切片进行后续实验。（2）免疫组化染色法测量肿瘤及癌旁正常组织中PSMA、CD31、IL-4、pSTAT6、CD 163、Sema4D、Plexin-B1的表达量。（3）免疫荧光双标法测量肿瘤及癌旁正常组织中Ki-67与IL-4、CD163与Sema4D、CD31 与Plexin-B1、CD31 与PSMA的表达量。四、结果1、膀胱移行细胞癌细胞系通过分泌IL-4促进STAT6磷酸化诱导巨噬细胞极化为M2型 Mφ。光学显微镜观察发现THP-1细胞为悬浮细胞,表现为形态规则、大小一致、无伪足的小圆形细胞。M0型Mφ为贴壁细胞,表现为形态不规则的多边形细胞,体积略增大。M1型Mφ细胞表现为体积增大、多角的长梭形细胞。M2型Mφ细胞表现为体积增大的枝杈状细胞。Western blot、RT-PCR检测M1型Mφ中CD80和iNOS表达增加,CD163和Arg-1表达较低;M2型Mφ和T24+M0共培养组中CD163和Arg-1表达增加,CD80和iNOS表达较低。加入IL-4R和STAT6抑制剂AS1517499后,CD163表达降低。ELISA结果显示M2以及T24+M0组细胞培养上清液中IL-4含量较高,M0和M1组中IL-4含量均较低。2、M2型Mφ促进促血管生成因子Sema4D的表达和分泌。RT-PCR、ELISA检测M2、T24+M0组中Sema4D表达升高,加入IL-4R或AS1517499后Sema4D表达降低。免疫组化结果显示肿瘤组织中Sema4D表达率明显高于癌旁正常组织。免疫荧光结果表明,CD163+细胞（M2型Mφ）中Sema4D在肿瘤组织中表达率明显高于癌旁正常组织。3、PSMA抑制剂2-PMPA抑制肿瘤组织中CD31表达和M2型Mφ浸润性及其Sema4D 表达。应用PSMA抑制剂2-PMPA,移植瘤中位增长体积和重量明显低于对照组,30天后实验组裸鼠移植瘤体积明显低于对照组。免疫组化染色法显示实验组中CD31、Plexin-B1、CD163、Sema4D表达率明显低于对照组,免疫荧光双标法显示,实验组中PSMA在CD31+肿瘤新生血管表达率明显低于对照组,Sema4D在CD163+M2型Mφ中表达率明显低于对照组,表明2-PMPA可以减少肿瘤组织中微血管密度（CD31+细胞）以及M2型Mφ浸润性及其Sema4D表达。4、膀胱癌组织中PSMA和CD31表达率与肿瘤TNM分期和病理分级呈正相关,可能是膀胱癌患者预后的影响因素。免疫组化结果表明,高级别病理分级肿瘤患者中CD31+细胞计数明显高于低级别,且CD31+细胞计数随T分期增加而增加,即T4期最高,T3期次之,T2期最低。免疫荧光双标法结果揭示肿瘤新生血管中PSMA表达呈现相同的结果,高级别患者中PSMA表达率明显高于低级别,且T4期PSMA表达率最高,T3期和T2期较低。单因素和多因素分析显示,PSMA和CD31表达率是影响膀胱癌患者预后的影响因素,但彼此之间有相互影响作用。5、T2和T3期膀胱癌组织中M2型Mφ上调CD31和PSMA表达,而T4期中上皮-间质转化（EMT）程度上调CD31和PSMA表达。免疫组化结果显示T3期中CD163+细胞计数最高,而T2、T4期较低,表明M2型Mφ浸润程度在T3期最高,T2和T4期较低。免疫荧光显示N-cadherin/ZO-1比例在T4期最高,T3和T2期较低,表明T4期肿瘤发生上皮-间质转化（EMT）。因此,结合PSMA与CD31表达率在T分期中的表达规律,T2和T3期中M2型Mφ上调CD31和PSMA表达,T4期中上皮-间质转化（EMT）程度促进CD31和PSMA表达。五、结论1、膀胱移行细胞癌细胞分泌IL-4,促进肿瘤微环境巨噬细胞中STAT6磷酸化,上调Arg-1表达,诱导极化为M2型Mφ,从而表达和分泌Sema4D。2、PSMA表达与肿瘤组织中CD31表达密切相关,从而辅助评估膀胱移行细胞癌患者的预后。3、T2期和T3期,M2型Mφ通过分泌Sema4D并表达Plexin-B1,上调肿瘤组织中CD31和PSMA表达。而在T4期,上皮-间充质转化（EMT）程度上调肿瘤组织中CD31和PSMA表达。