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芋螺(Conus)是软体动物门腹足纲前鳃亚纲芋螺科的肉食性贝类的总称,属于最古老的海洋生物之一。芋螺毒素(conotoxin)是从芋螺毒液中获得的一类具有生物活性的小分子肽类毒素,主要用于防御和捕食。芋螺毒素结构致密稳定,富含二硫键,能特异性地作用于多种电压门控离子通道(Ca2+、Na+、K+等)和神经递质受体。据估计,全世界芋螺超过500种,其活性成分众多,被认为是一种极其丰富的神经药理活性多肽库,具有很高的理论与应用研究价值。本研究旨在建立高密度二硫键芋螺毒素表达体系,获得两种新型芋螺毒素Lt12.14和Di25及Di25的两个截短体Di25-12C和Di25-14C,为以后研究其功能与构效关系及作用靶位奠定基础。芋螺毒素Lt12.14和Di25是本课题组在前期实验中发现并命名的,最突出的特点是含有高密度二硫键。Lt12.14来自于信号芋螺,含有5对二硫键,分子量为4681.4Da;Di25来自长距芋螺,含10对二硫键,分子量为12671.1Da;截短体Di25-12C和Di25-14C的分子量分别为6876.7Da、8601.7Da,其名称后的12C和14C代表分别含有6对和7对二硫键。基因工程领域中,大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统被广泛使用,我们在构建表达载体时,这两种系统都作了尝试。实验中采用的大肠杆菌表达宿主菌有 E.coli BL21(DE3)、E.coliBL21(DE3)pLysS和E.coli BL21 Rosetta(DE3),表达载体有 pET-22b(+)、pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-32a(+)和 pNovoTrx-EK;酵母表达菌株为毕赤酵母 GS115,载体为 pPIC9。根据 Lt12.14、Di25、Di25-12C 和 Di25-14C的基因序列分别设计引物,以其cDNA为模板进行PCR扩增基因片段。经过PCR扩增后,根据目的片段的长度,对特异性条带进行回收。用相对应的核酸限制性内切酶分别对回收产物及表达载体进行双酶切反应。使用T4 DNA连接酶分别对双酶切纯化后的目的片段和相对应的载体进行连接,然后转化至E.coliDH5α感受态细胞。挑取分离较好的单菌落,采用菌落PCR法初步鉴定,并对阳性克隆子提取质粒。对于原核表达,将测序正确的质粒直接转化大肠杆菌进行诱导表达;在酵母表达体系中,将质粒线性化后再转化毕赤酵母GS115进行诱导表达。在表达产物分离纯化时,高速离心分离菌体和上清,大肠杆菌表达收集菌体弃掉上清,酵母表达收集上清液弃掉菌体,再用Ni-NTA亲和柱、Sephadex G-25、TSK-GEL SW型凝胶色谱柱等分离纯化。纯化产物采用Tricine SDS PAGE、Western Blot、LC-MS-MS及MALDI-TOF-MS检测和鉴定。依据表达类型,实验结果如下:1.Western Blot 结果显示,重组芋螺毒素 Lt12.14 在 pET-22b(+)和 pET-24a(+)载体中均获得可溶性表达,其中在pET-22b(+)中的原核分泌表达经BCA法测得,最终纯化产率为82μg/L。2.Tricine SDS PAGE 显示,Lt12.14、Di25-12C、Di25-14C 和 Di25 在 pET-32a(+)和pNovoTrx-EK载体中均成功融合表达。其中Lt12.14和Di25-12C在两个载体中的表达产物都是可溶的,Di25在pET-32a(+)中的表达产物是可溶的,在pNovoTrx-EK中表达形成包涵体,而Di25-14C在两载体中的表达产物主要形成包涵体。Lt12.14和Di25-14C在pET-32a(+)中纯化产率经BCA法测得分别为1.8mg/L和1.5mg/L,重组芋螺毒素Di25-14C经肠激酶酶切,LC-MS-MS测定氨基酸序列显示,切下的目的片段与Di25-14C的序列匹配度为61%。3.Tricine SDS PAGE和Western Blot表明,Lt12.14、Di25-12C、Di25-14C和Di25均在毕赤酵母GS115中获得表达,其中重组芋螺毒素Lt12.14、Di25-14C和Di25的纯化产率分别为2mg/L、1.7mg/L和6mg/L,经MALDI-TOF-MS测定重组的Lt12.14和Di25分子量正确。