豆科植物-根瘤菌共生固氮是生物固氮体系中最强的共生系统,主导着地球的氮素循环,在改善土壤质量、影响植被演替以及生态修复中起着极其重要的作用。在多种多样的根瘤共生体系中,相对其它作物栽培系统而言,草地系统的共生根瘤菌显示出更加明显的丰富多样性。受地形、气候、土壤结构等综合因素的影响,贵州喀斯特地区生长着大量不同种类的天然豆科牧草,蕴藏着丰富的根瘤菌自然资源。开展贵州天然豆科牧草根瘤菌的资源调查,掌握其区系分布特征,能为根瘤菌在区域农牧业生产及生态环境建设中的应用提供宝贵的种质资源,并在增加对本地区天然豆科牧草及其根瘤菌共生资源多样性与特异性认识的同时,为制备高效复合接种剂并在生产中推广应用奠定可靠的物质基础。本文通过对贵州省黔中、黔东北、黔东南、黔南、黔西南、黔北、黔西北地区共49个县市的天然豆科牧草根瘤菌的资源调查,行程8000多公里,涵盖贵州省全部五个生态功能区,共采集到根瘤样品352份,包括天然豆科牧草22种。在调查采集的全部样品中,以白三叶根瘤样品最多,另外采得的根瘤样品相对较多的野生牧草种类分别为多花木蓝、葛藤、天蓝苜蓿和野豌豆。在所采集的根系样品中,无论是在低洼潮湿地带还是坡坎干燥环境中生长的白三叶、天蓝苜蓿、野豌豆和鸡眼草,无一例外的都有根瘤形成,且根瘤数量较多,结瘤率100%;野大豆主要生长在贵州岩溶山区的石灰岩土壤缝穴中,扎根深厚,根瘤硕大,结瘤率也很高。这在一定程度上说明了在贵州地区自然生长的白三叶、天蓝苜蓿、野豌豆、鸡眼草和野大豆与根瘤菌的共生结瘤具有稳定性、强大性与区域分布的广泛性,它们应属于贵州喀斯特地区的先锋固氮植物。在调查采集的其余17种天然豆科牧草根系样品中,结瘤率分布在75%~85%之间。所采集到的根瘤多以球形、掌状、柱状为主,并有少量的扇形和花瓣形,更有个别的呈花朵形。根瘤颜色多以白色、粉色和绿色为主,兼有白-粉-绿、黄-粉-绿、浅褐-粉-绿、粉-绿-褐、白-浅褐、白-粉、白-绿等三色和两色相间排列的多重色彩。在根瘤菌资源调查过程中还发现,遵义地区采集到的多花木蓝几乎不结瘤;六盘水、毕节地区葛藤分布很少;遵义、安顺地区未发现天蓝苜蓿。这说明天然豆科牧草的种类分布具有区域特异性,根瘤菌的共生结瘤除了受到豆科植物的种类限制以外,同时还受到生态地理环境的直接影响。从采集的352份天然豆科牧草的根瘤样品中,先后分离得到863个具有典型根瘤菌菌落特征的纯化菌株,经革兰氏染色鉴定获得G-菌739株;菌体形状在显微镜下多呈杆状,少数为椭圆形、有鞭毛着生,或者呈小菌体的串珠状。利用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取739株革兰氏阴性菌菌株的基因组DNA,选用P1-P6引物对扩增各菌株的16S r DNA片段,将PCR产物纯化后送北京擎科新业生物技术有限公司昆明分公司测序。将测得的菌株序列使用NCBI中的Blast软件在线比对,并从Gen Bank数据库中下载与待分析序列相近的已知种模式菌株的16S r DNA序列,用DNAMAN进行多重比对,确定了各分离菌株的分类地位。分子鉴定结果表明,在409株G-菌株中,共鉴定出11个属80个种,其中以Pseudomonas(假单胞菌属)中的种类最多,高达21种,其次分别为Rhizobium(根瘤菌属,19种)、Mesorhizobium(中慢生根瘤菌属,9种)、Bradyrhizobium(慢生根瘤菌属,8种)、Sinorhizobium(中华根瘤菌属,8种)、Burkholderia(伯克氏菌属,7种)、Agrobacterium(土壤杆菌属,3种)、Ochrobactrum(苍白杆菌属,2种)、Cupriavidus(含铜菌属,1种)、Herbaspirillum(草螺菌属,1种)、Paraburkholderia(伴伯克氏菌属,1种)。在鉴定出的11个属80个种中,以Rhizobium中的优势种R.leguminosarum发生频率最高,达23.23%;其次分别为Agrobacterium中的优势种A.tumefaciens,其发生频率为5.38%、Sinorhizobium中的优势种S.meliloti,该种的发生频率为4.40%、Bradyrhizobium中的优势种B.japonicum,其发生频率为2.44%;分布频率较低的是Pseudomonas中的优势种P.moraviensis,该种的发生频率为2.20%、Burkholderia中的优势种B.bacterium,其发生频率为2.20%、Mesorhizobium中的优势种M.loti,该种的发生频率为1.22%;另外,Herbaspirillum、Paraburkholderia均只有一个种,分别为Herbaspirillum huttiense、Paraburkholderia phytofirmans,其发生频率分别为1.22%、0.49%;Ochrobactrum中的O.anthropi、O.grignonense与Cupriavidus中的C.gilardii,其发生频率一致均为0.24%。在资源分布较为丰富的优势天然豆科牧草种类中,从白三叶的分离菌株中共鉴出7个属39个种,其中Rhizobium leguminosarum的分布频率最高,达到34.45%;其次是Rhizobium anhuiense(16.69%)和Rhizobium laguerreae(11.66%),它们是所调查地区范围内白三叶根瘤菌中的优势种类。从多花木蓝的分离菌株中共鉴出6个属18个种其中Bradyrhizobium japonicum的分布频率最高(16.00%),其次是Bradyrhizobium elkanii(8.00%)、Agrobacterium tumefaciens(8.00%)、Burkholderia bacterium(8.00%)和Rhizobium herbae(8.00%),它们是所调查地区范围内多花木蓝根瘤菌中的优势种类。从葛藤样品的分离菌株中鉴出7个属15个种,其中Rhizobium leguminosarum的分布频率最高(14.30%);其次是Pseudomonas koreensis(10.70%)、Bradyrhizobium japonicum(10.70%)和Herbaspirillum huttiense(10.70%),它们是所调查地区范围内葛藤根瘤菌中的优势种类。在天蓝苜蓿样品的分离菌株中共鉴出6个属23个种,其中Sinorhizobium meliloti的分布频率最高(32.60%);其次是Sinorhizobium arboris(8.70%)和Rhizobium leguminosarum(6.50%),它们是所调查地区范围内天蓝苜蓿根瘤菌中的优势种类。本研究为根瘤菌在区域农牧业生产及生态环境建设中的应用提供了宝贵的种质资源。