【摘 要】
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实验目的:心脏纤维化是心血管疾病晚期最常见的病理改变,是导致心力衰竭的主要原因之一。成年心肌细胞不具备再生能力,在心脏受到感染或机械、化学损伤后常导致心肌细胞不断减少,炎性细胞（尤其是巨噬细胞）浸润,成纤维细胞增多并活化成肌成纤维细胞,细胞外基质分泌增多并改变基质胶原成分,进而发生心脏纤维化。心脏纤维化是心肌细胞损伤后的一种修复机制,然而,纤维化后引起的心脏收缩能力下降、心电传导障碍,导致心脏顺应
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实验目的:心脏纤维化是心血管疾病晚期最常见的病理改变,是导致心力衰竭的主要原因之一。成年心肌细胞不具备再生能力,在心脏受到感染或机械、化学损伤后常导致心肌细胞不断减少,炎性细胞（尤其是巨噬细胞）浸润,成纤维细胞增多并活化成肌成纤维细胞,细胞外基质分泌增多并改变基质胶原成分,进而发生心脏纤维化。心脏纤维化是心肌细胞损伤后的一种修复机制,然而,纤维化后引起的心脏收缩能力下降、心电传导障碍,导致心脏顺应性下降,排血功能减弱,心功能不全甚至衰竭。在心脏纤维化的发生发展过程中,巨噬细胞扮演着不可或缺的角色,其具体机制是当下研究重点。Cdc42是Rho家族的一类小分子开关蛋白,它的发现使人们在细胞迁移、极化、囊泡运输、细胞周期以及细胞骨架调节等生命活动的认识上逐步加深。Cdc42参与巨噬细胞的迁移及吞噬,巨噬细胞在心脏纤维化中的作用尚未见报道。本课题将探究巨噬细胞特异性缺失Cdc42对异丙肾上腺素诱导心脏纤维化的影响及其分子机制。实验方法:1.利用巨噬细胞特异性表达Cre重组酶的Lyz2 Cre小鼠与Cdc42fl/fl小鼠杂交得到巨噬细胞特异性敲除Cdc42小鼠;2.皮下注射异丙肾上腺素（Isoproterenol,ISO）建立小鼠心脏纤维化模型;采用Vevo3100超声心动仪以及心电图检测心功能,动物血液细胞分析仪检测血常规相关参数;3.小鼠心脏组织分别进行固定、脱水、包埋、切片。HE染色和马森染色检测心脏组织结构及纤维化程度,免疫组织荧光检测巨噬细胞的含量等情况;4.提取小鼠心脏组织蛋白及RNA,检测心脏纤维化相关基因的表达情况;5.提取原代骨髓巨噬细胞及成纤维细胞,探究巨噬细胞与成纤维细胞的相互作用机制。实验结果:1.成功构建巨噬细胞特异性敲除Cdc42小鼠（FF+）,FF+小鼠巨噬细胞Cdc42的m RNA与蛋白质水平表达均明显减少;2.成功构建ISO诱导的心脏纤维化模型,巨噬细胞特异性敲除Cdc42显著降低心脏搏血功能,降低血常规白细胞与中间细胞的数量,增加心电图QRS波群时长;3.巨噬细胞特异性敲除Cdc42明显增加ISO刺激后心脏组织中巨噬细胞的含量,显著加重心脏纤维化;4.巨噬细胞特异性敲除Cdc42明显增加ISO诱导的心脏中白介素10（IL-10）含量,显著减少基质金属蛋白酶MMP9与TGF-β的含量;5.Cdc42缺失显著增加ISO诱导的原代小鼠巨噬细胞中TGF-β含量,但其分泌的上清中TGF-β含量明显减少;采用此上清刺激心脏成纤维细胞,明显增加细胞中CollagenⅢ与α-SMA的表达,但磷酸化p-Smad3并未明显增加。结果表明,巨噬细胞缺失Cdc42可能通过TGF-β之外的其他信号通路促进成纤维细胞激活。结论:巨噬细胞特异性敲除Cdc42明显增加ISO刺激后心脏组织中巨噬细胞的募集,显著加重心脏纤维化,加重心脏功能障碍。Cdc42敲除巨噬细胞可能通过TGF-β之外的其他信号通路促进成纤维细胞激活,通过减少MMP9合成分泌,加重心脏纤维化。
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