目的:探讨人喉鳞癌组织及癌旁正常黏膜组织的蛋白质样品制备方法,建立人喉鳞癌组织及其癌旁正常黏膜组织的双向凝胶电泳图谱,并识别鉴定其差异表达的蛋白质。验证候选蛋白MRP8及CypA在喉鳞癌组织及其癌旁正常黏膜组织的表达差异,并结合临床病例的病理特征探讨MRP8的临床意义。方法:1、收集,筛选人喉正常黏膜组织,鳞癌组织标本各10例,分析样本组织学信息,应用固相pH梯度双向凝胶电泳分离组织的总蛋白质,凝胶经考染显色后,用ImageMaster2D软件分析双向电泳图谱。2、用ImageMaster 2D图像分析软件比较分析人喉鳞癌组织及其癌旁正常黏膜组织的双向凝胶电泳图谱,以识别差异表达的蛋白质;应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, MALDI- TOF- MS)分析差异表达的蛋白质,得到肽质量指纹图(peptide masses fingerprint,PMF),使用国际互联网上Matrix Science公司提供的PMF鉴定程序(Mascot:Peptide Mass Fingerprint)搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。3、采用免疫组织化学法和免疫印迹法对喉鳞癌及正常喉黏膜组织中MRP8及CypA的表达情况进行验证,并结合临床病理特征分析其表达的临床意义。结果:1、建立了人喉正常黏膜和喉鳞癌组织蛋白质分辨率较高和重复性较好的双向电泳图谱,得到清晰度、斑点数满意的图像,通过ImageMaster 2D Elite 4.01图像分析软件对其进行点分析,喉癌组织及对照组喉正常黏膜组织两个样品以p I= 4-8和分子质量20.1-116kd范围的蛋白斑点分布最多。喉鳞形细胞癌及对应喉正常黏膜组织3块凝胶的平均蛋白质点数分别为1351±47和1033±23。将其中的一块胶定为参考胶,进行3块胶间的蛋白质点匹配,喉鳞形细胞癌及对应喉正常黏膜组织平均匹配的点数分别为1 236±18和943±16,匹配率达91.5%和91.2%。同一癌组织的3块胶的蛋白质点在位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为(0.973±0.125) mm。在SDS-PAGE方向上的偏差为(1.025±0.213)mm。对10例喉鳞癌组织和10例人喉正常黏膜组织分别同时进行双向凝胶电泳,发现10例癌组织图谱较相似,利用ImageMaster 2D Elite 4.01分析软件对其进行分析匹配,建立了10块胶的平均凝胶图,点检测共有蛋白质点1236个。用相同的方法对10例人喉正常黏膜的双向凝胶电泳图谱进行软件分析,亦建立起其平均凝胶图,点检测共有蛋白质点943个。2、鉴定出与喉癌发生密切相关的13种蛋白质。其中有10种蛋白质在喉癌组织中上调,分别是Cofilin-1,Nuclear body protein SP140,GRP94, HSP 90, GSTP1-1, Superoxide dismutase [Mn], Cyclophilin A , Proteasome activator complex subunit 2 , Apolipoprotein A-Iprecursor , CaM-like protein。3种蛋白质在喉癌组织中下调,分别是Fatty acid-binding protein (E-FABP),Calgranulin A,Calgranulin B。3、免疫印迹结果提示:两例高分化喉鳞癌组织及正常喉黏膜组织中MRP8及CypA均阳性表达,MRP8在喉鳞癌组织中的表达强度低于正常喉黏膜组织,CypA在喉鳞癌组织中的表达强度高于正常喉黏膜组织。4、免疫组织化学结果显示:CypA在喉鳞癌及正常喉黏膜组织中均有很高的表达率,但在肿瘤组织中的强阳性及阳性表达例数较正常组织高;MRP8在喉鳞癌及喉部正常组织中亦有较高的阳性表达率,在喉鳞癌中的阳性表达率低于喉部正常黏膜组织;同时在喉鳞癌中随着癌组织分化程度的增高MRP8阳性表达率下降;MRP8及CypA在喉鳞癌中的阳性表达率均与患者的年龄、性别无关。结论:1、用优化的喉鳞癌组织及正常喉黏膜组织的蛋白质样品制备方法,成功建立了分辨率较高且重复性好的人喉鳞癌组织及正常喉黏膜组织的双向凝胶电泳图谱。2、本研究首次鉴定出了与喉癌的发生密切相关的13种蛋白质,它们分别参与细胞的癌变和凋亡、细胞自身防御、细胞间的信号传导、提示多种蛋白分子可能为喉癌诊断和治疗相关的肿瘤标志物,与喉癌的癌变机制可能有关。3、MRP8的表达程度与肿瘤的分化程度关系密切,低分化组织表达明显减少,高分化组织表达明显增高,中分化组织居中,MRP8的表达下降伴随着喉组织恶性程度的加深,对MRP8表达程度的检测有助于判断组织的恶性程度极其预后,有意于研究喉癌的发生发展。