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目的1、观察不同REM睡眠剥夺时长对小鼠海马白细胞介素33(Interleukin-33,IL-33)蛋白表达的影响。2、观察海马IL-33表达变化对REM睡眠剥夺小鼠认知功能的影响。3、观察IL-33对REM睡眠剥夺小鼠海马小胶质细胞、炎性因子和凋亡调控因子表达的影响。初步探讨IL-33在小鼠REM睡眠剥夺后认知功能损伤中的作用及其相关作用机制。方法采用改良型多平台水环境法(Modified multiple platforms method,MMPM)建立小鼠REM睡眠剥夺模型。各组小鼠造模过程中保证12h光照(9:00-21:00),12h黑暗(21:00-9:00)。1.将C57BL/6J成年雄性小鼠随机分为4组,每组6只:空白对照组(Cage Control,CC):饲养7天;REM睡眠剥夺1天组((Sleep deprivation 1 day,SD1d):饲养7天后采用MMPM法进行REM睡眠剥夺1天;REM睡眠剥夺2天组(SD2d):饲养7天后采用MMPM法进行REM睡眠剥夺2天;REM睡眠剥夺3天组(SD3d):饲养7天后采用MMPM法进行REM睡眠剥夺3天。造模结束后心脏灌注处死。采用蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)法检测各组小鼠海马IL-33蛋白的表达情况。2.将C57BL/6J成年雄性小鼠随机分为3组,每组6只:CC组:饲养7天;REM睡眠剥夺组(SD):饲养7天,采用MMPM法进行REM睡眠剥夺3天,睡眠剥夺过程中每天9:00腹腔注射无菌PBS(0.01mg/kg),连续3天;REM睡眠剥夺+腹腔注射重组IL-33组(SD+IL-33):饲养7天,采用MMPM法进行REM睡眠剥夺3天,睡眠剥夺过程中每天9:00腹腔注射重组IL-33(0.01mg/kg),连续3天。(1)采用水迷宫实验、旷场实验、新事物探索实验对各组小鼠进行认知功能测试;(2)采用免疫组化染色和Western Blot法观察各组小鼠海马IL-33表达情况;(3)采用免疫荧光染色观察各组小鼠海马小胶质细胞活化情况;(4)采用Western Blot检测各组小鼠海马TLR4、TNF-α、IL-1β蛋白的表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组小鼠海马TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、IL-10、CD206 mRNA的表达情况;(5)采用Western Blot检测各组小鼠海马Caspase-9、Bcl-2蛋白的表达情况。结果1.WesternBlot结果显示,与CC组相比较,SD1d、SD2d、SD3d组海马IL-33蛋白表达量均下降,差异具有统计学意义(p<0.05);在SD3d内,随睡眠剥夺时间的延长,海马IL-33蛋白表达量下降越明显,于SD3d时,海马IL-33蛋白表达量最低,差异具有统计学意义(p<0.05)。2.免疫组化结果显示,与CC组相比,SD组小鼠海马IL-33阳性细胞数减少,差异具有统计学意义(p<0.05));与SD组相比,SD+IL-33组小鼠海马IL-33阳性细胞数增多,差异具有统计学意义(p<0.05)。WesternBlot结果显示,与CC组相比,SD组小鼠海马IL-33蛋白表达减少,差异具有统计学意义(p<0.05));与SD组相比,SD+IL-33组小鼠海马IL-33蛋白表达增多,差异具有统计学意义(p<0.05)。3.水迷宫实验结果显示,与CC组相比,SD组小鼠位于目标象限时间减少;与SD组相比,SD+IL-33组小鼠位于目标象限的时间增加,但差异均无统计学意义(p>0.05,p>0.05)。旷场实验结果显示,与CC组相比,SD组小鼠位于中心观察区的时间减少,差异具有统计学意义(p<0.001),与SD组相比,SD+IL-33组小鼠位于中心观察区的时间增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。新事物探索实验结果显示,与CC组相比,SD组小鼠对新事物探索时间减少,差异具有统计学意义(p<0.05));与SD组相比,SD+IL33组小鼠对新事物探索时间增加,差异具有统计学意义(p<0.05)。4.免疫荧光单标结果显示:与CC组相比,SD组小鼠海马Iba1+细胞数目增多,差异具有统计学意义(p<0.05);与CC组相比,SD+IL-33组小鼠海马Iba1+细胞数目增多,差异具有统计学意义(p<0.05);但SD与SD+IL-33组之间比较小鼠海马Iba1+细胞数目无显著改变。免疫荧光双标结果显示:与CC组相比,SD组小鼠海马iNOS+/Iba1+细胞数目增多,差异具有统计学意义(p<0.05);与SD组相比,SD+IL-33组小鼠海马iNOS+/Iba1+细胞数目减少,差异具有统计学意义(p<0.05)。5.Western Blot结果显示,与CC组相比,SD组小鼠海马促炎因子TLR4、TNF-α、IL-1β蛋白表达增多,差异具有统计学意义(p<0.05));与SD组相比,SD+IL-33组小鼠海马促炎因子TLR4、TNF-α、IL-1β蛋白表达减少,差异具有统计学意义(p<0.05)。RT-qPCR结果显示,与CC组相比,SD组小鼠海马促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的mRNA表达增多,抑炎因子IL-10和CD206的mRNA表达减少,差异具有统计学意义(p<0.05);与SD组相比,SD+IL-33组小鼠海马促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18的mRNA表达减少,抑炎因子IL-10和CD206的mRNA表达增多,差异具有统计学意义(p<0.05)。6.Western Blot结果显示,与CC组相比,SD组小鼠海马Caspase-9蛋白表达增多,Bcl-2蛋白表达减少,差异具有统计学意义(p<0.05);与SD组相比,SD+IL-33组小鼠海马Caspase-9蛋白表达减少,Bcl-2蛋白表达增多,差异具有统计学意义(p<0.05)。结论1.睡眠剥夺抑制小鼠海马IL-33的表达,在睡眠剥夺3天内,随睡眠剥夺时间延长,其表达呈下降趋势,于第3天减少最显著;睡眠剥夺小鼠腹腔注射重组IL-33后海马IL-33表达增多,睡眠剥夺后的认知功能损害得到改善。2.睡眠剥夺后M1型小胶质细胞表达增多,IL-33可能通过参与调节小胶质细胞M1型向M2型的极化,抑制M1型相关促炎细胞因子TLR4、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18过度表达,诱导M2型相关抗炎因子CD206、IL-10表达增多,在睡眠剥夺小鼠海马炎症反应中起保护作用。3.睡眠剥夺后海马促凋亡因子Caspase-9表达增加,抗凋亡因子Bcl-2表达减少,IL-33可能参与调控睡眠剥夺后海马凋亡相关因子的表达,抑制Caspase-9过表达,诱导Bcl-2表达增加,在小鼠睡眠剥夺后海马损伤中起保护作用。综上所述,IL-33可能通过影响睡眠剥夺后小胶质细胞的极化,抑制神经炎症及抗凋亡反应,进而改善睡眠剥夺后认知功能障碍。IL-33在改善睡眠剥夺伴认知功能损伤中的作用机制,可能为睡眠相关疾病的基础研究到临床治疗的转化提供新的理论支持。