背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性的、炎症性的自身免疫性疾病,主要表现为持续的滑膜炎症性浸润、骨和软骨的损伤,甚至导致关节畸形以及功能丧失,并可能伴有心血管、呼吸及骨骼等系统性并发症。RA的病因复杂,发病机制尚不清楚。已发现在RA患者血液、关节滑膜组织(液)中存在多种自身抗体及其与自身抗原形成的免疫复合物(immune complex，IC)。IC通过与补体成分、细胞Fc受体和补体受体结合诱导促炎症性细胞因子的产生可能是RA炎症反应导致关节骨和软骨组织损伤和关节畸变的最主要机制。近年来的研究表明,关节滑膜IC的沉积与RA的发病有着密切的关系。尽管目前在RA患者血液及关节滑膜组织(液)中已经发现多种自身抗原成分,例如波形蛋白、纤维蛋白原、II型胶原和纤连蛋白等。但是,导致RA关节自身免疫损害的确切靶抗原还未完全明确,特别是对RA患者关节滑膜组织IC中抗原谱的研究尚有限。本实验采用蛋白质组学的策略,通过免疫沉淀、胶内酶解和液相色谱串联质谱系统对RA患者关节滑膜IC中的蛋白质抗原成分进行分析。通过RA和骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者关节滑膜IC抗原谱的比较,一方面验证RA中已发现的自身抗原,另一方面为寻找新的RA早期诊断的生物标志物提供实验与理论依据。目的采用质谱技术对RA患者关节滑膜IC进行全面的抗原谱分析,以期发现具有特异性的自身抗原。采用原核表达系统表达和纯化H2A蛋白;建立了检测血清中抗H2A抗体的间接ELISA方法,并初步应用于临床标本的检测。方法选取南京军区南京总医院3例RA患者和3例OA患者的关节滑膜,通过蛋白提取、免疫沉淀、胶内酶解和液相色谱串联质谱系统,对滑膜IC进行抗原谱分析。用FOT值(fractionoftotal)来评价蛋白的丰度,通过FOT值的比较筛选出上调蛋白和下调蛋白。用David和String软件对差异蛋白进行功能富集、相互作用网络和信号通路分析。本实验挑选仅出现在RA-IC中的组蛋白H2A进行进一步验证实验。人工合成H2A cDNA,经PCR扩增、限制性酶切、DNA连接、转化、克隆、测序鉴定等步骤,构建H2A重组质粒H2A/pET28a。将H2A/pET28a转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导使H2A-His融合蛋白在DE3中得到表达;用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。以纯化人H2A为包被抗原,建立检测血清抗H2A自身抗体的水平的间接ELISA技术。结果在RA和OA患者的关节滑膜组织IC中分别鉴定到了 511和526种蛋白质。通过维恩图比较,发现相对于OA组,仅在RA组出现的蛋白有170种,RA和OA组的共有蛋白有341种,仅在OA组出现的蛋白有185种。通过FOT值的比较,发现RA组有45种蛋白发生上调,85种蛋白发生下调。组蛋白H2A、玻连蛋白、硫氧还蛋白和人类白细胞抗原HLA-G仅出现在RA-IC中;热休克蛋白HSP90AA1在RA中表达上调。本实验经PCR扩增、限制性酶切、DNA连接、转化、克隆鉴定等步骤,成功构建了 H2A重组质粒H2A/pET28a。将H2A/pET28a转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),经 IPTG 诱导及 Ni-IDA-Sepharose CL-6B 亲和层析柱在 DE3 中并纯化H2A蛋白。以纯化人H2A为包被抗原,建立了检测血清抗H2A自身抗体的水平的间接ELISA技术。抗体阻断实验考察方法的特异性,阻断率为66.4%;用抗组蛋白H2A抗体高、中、低三个浓度标本重复检测10次,试验的批内变异系数(CV)分别为5.1%、7.5%和6.6%,批间CV分别为7.7%,9.5%和8.4%。对50份RA患者和50份健康体检者血清检测结果表明,抗组蛋白H2A抗体检测诊断RA的AUCROC面积为0.884,当A值为0.494时,敏感性(84%)、特异性(80%)最高,以0.494为cutoff值,RA患者血清抗H2A抗体的阳性率为84%,明显高于健康对照组的阳性率20%(p<0.01)。结论质谱鉴定结果表明,在RA-IC中出现的热休克蛋白HSP90AA1、人类白细胞抗原HLA-G、硫氧还蛋白、膜联蛋白A2、玻连蛋白和组蛋白H2A可能通过不同的机制参与RA的发病过程,具有RA新的生物标志物的潜在应用价值。RA患者血清抗H2A抗体水平明显高于健康对照组,血清中抗H2A抗体水平的检测可能在RA的辅助诊断中具有一定作用。