论文部分内容阅读
白念珠菌（Candida albicans）是人体中最常见的条件性致病真菌之一,能够在免疫力低下时感染宿主,引起皮肤、黏膜、组织、脏器等的感染,甚至导致死亡。目前治疗白念珠菌主要依赖抗真菌药物,如氟康挫、酮康挫、卡泊芬净等,但是由于药物的滥用,越来越多的抗药菌株出现,白念珠菌的治疗难度进一步加大。因此,深入了解白念珠菌的生理特性和致病机制迫在眉睫。自噬是细胞为维持内环境稳态而进行的程序性死亡过程。当细胞受到营养饥饿压力、氧化压力、有毒物质等刺激时,细胞通过自噬清除自身异常折叠的蛋白质、衰老或过剩的细胞器,及时更新细胞组分,使细胞处于良好的生理状态。目前已对酿酒酵母进行了较为深入的自噬研究,但对于白念珠菌自噬我们仍知之甚少。肌醇多磷酸是真核细胞中的肌醇衍生物,负责其合成的肌醇多磷酸激酶对真菌自噬、毒力、细胞生长及形态维持都具有重要作用。在酿酒酵母和粟酒裂殖酵母中,Vip1作为IP6（肌醇六磷酸酯,inositol hexaphosphate）激酶,负责将IP6磷酸化为IP7（肌醇七磷酸酯,diphosphoinositol pentakisphosphate）,对菌株细胞生长、形态维持、凋亡和盐胁迫压力应答等至关重要。但是Vip1在人体最常见的病原真菌——白念珠菌中的作用和功能研究却很少,对其在自噬方面的功能更是几乎没有研究。由于肌醇多磷酸激酶和自噬对病原真菌在宿主体内的存活、侵染都至关重要,对Vip1进行自噬功能方面的研究能够帮助我们丰富对白念珠菌肌醇代谢网络和自噬过程的了解,有利于进一步了解白念珠菌的致病机制,为临床治疗白念珠菌提供更多理论依据。本研究主要以肌醇多磷酸激酶Vip1为研究对象,探究了Vip1在白念珠菌选择性自噬Cvt途径、线粒体自噬和毒力方面的功能,以及ATG8、VIP1双基因缺失对菌丝发育、细胞壁压力及组分变化等方面作用,主要研究内容如下:（1）构建vip1?/?缺失菌株及回补菌株。发现VIP1基因缺失之后,氮源饥饿耐受能力减弱,自噬相关蛋白Atg8降解、定位异常,以及自噬体的液泡转运能力受到抑制,说明VIP1缺失会导致对白念珠菌选择性自噬和非选择性自噬过程都受到抑制。（2）对于Cvt途径介导的选择性自噬过程进行研究,发现VIP1基因缺失之后,氮源饥饿条件下Cvt途径的必需蛋白Atg21定位异常,说明VIP1缺失会导致Cvt途径受损。深入研究发现,该条件下液泡p H升高,V-ATPase V1结构域定位异常,V-ATPase亚基蛋白基因表达下调,胞内ATP水平过高,表明Vip1可能参与影响V-ATPase的组装与活性,从而抑制Cvt途径。（3）对于线粒体自噬进行研究发现,Vip1不参与影响线粒体自噬过程。（4）构建atg8?/?vip1?/?缺失菌株,探究自噬相关基因缺失对白念珠菌菌丝发育及细胞壁压力的影响。发现VIP1基因缺失抑制菌丝发育能力、增强对细胞壁发育抑制药物的敏感性、细胞壁组分含量减少,ATG8、VIP1基因共同缺失会加剧该现象。说明自噬相关基因参与调控白念珠菌菌丝发育和细胞壁完整性维持,多个自噬相关基因的缺失会进一步抑制菌丝发育能力和细胞壁抗性。（5）自噬过程受损可能影响菌株毒力发挥,VIP1基因缺失导致白念珠菌系统性感染小鼠能力、深入侵染肾脏组织能力减弱,毒力减弱。