研究背景T细胞免疫球蛋白域与黏蛋白域(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain,TIM)家族是近年来新发现的的一个基因家族,参与多种免疫免疫性疾病的发生与发展。人类TIM家族包括三个成员,分别是TIM-1、TIM-3、TIM-4。TIM-4区别于TIM-1、TIM-3的关键点在于其选择性表达于抗原提呈细胞表面,特别是活化的树突状细胞以及巨噬细胞表面。近期文献报道,TIM-4可表达于DC来源的恶性肿瘤、恶性组织细胞肉瘤以及朗格汉斯细胞肉瘤,另有病例报告显示咽旁脂肪肉瘤中也可检测到TIM-4的表达。肺癌是一种高发病率及高致死率的常见恶性肿瘤,2014年最新统计数据显示,肺癌已经成为全球致死率最高的肿瘤,而其发病率也高居第二位。课题组前期研究表明,TIM-4在人非小细胞肺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织,其在肺癌组织中的表达水平与肿瘤分化程度显著负相关,且与肿瘤病人存活时间密切相关。文献报道,TIM-4IgV域具有可与整合素结合的Arg-Gly-Asp(RGD)基序,提示TIM-4可能具备一定的黏附功能。另外,TIM-4胞内段无酪氨酸活化基序,无法直接介导信号转导。那么,高表达的TIM-4在肺癌进展中发挥怎样的作用?其作用机制如何?本研究将利用细胞及动物模型探索TIM-4在肺癌发生发展中的具体作用及相关效应机制。TIM-4是TIM-1的天然配体,TIM-4与TIM-1相互作用可为T细胞提供协同刺激信号,促进T细胞活化增殖,也有研究表明TIM-4对T细胞活化呈双重调控效应。TIM-4还可促进Th0细胞向Th2方向分化,TIM-4的多态性可能影响其与Tim-1的结合,打破对Thl/Th2细胞平衡的调控,进而导致哮喘及过敏性鼻炎的发生。课题组前期研究发现,TIM-4可负调控巨噬细胞的活性,显著减轻ConA诱导的免疫性肝炎。另外,TIM-4可特异性结合磷脂酰丝氨酸,通过其IgV域的FG-CC’环识别凋亡细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸介导巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬,而凋亡细胞的清除障碍与自身免疫性疾病的发生密切相关。TIM-4缺陷小鼠出现T细胞和B细胞过度活化,凋亡小体清除障碍,自身抗体产生等自身免疫病样症状,TIM-4和乳脂球蛋白表皮生长因子8((milk fat globuleEGF factorⅧ,MFG-E8)同时敲除可促进自身免疫病的进展。最近文献报道,TIM-4对于小鼠类风湿性关节炎的发病具有双重性,并将TIM-4作为治疗关节炎的候选靶点。实验室前期研究结果表明,系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)病人外周血单个核细胞中TIM-4mRNA的表达水平显著高于正常人,且SLE患者TIM-4表达水平与疾病活动状态相关。那么TIM-4在SLE这一典型自身免疫病中究竟扮演什么角色呢?本研究利用SLE动物模型初步探讨了TIM-4在SLE进展中的作用。研究目的阐明TIM-4在肺癌发生、进展中的作用及相关机制,为肺癌预防、诊断和治疗提供新的候选靶点；初步探讨TIM-4在SLE进展中的作用,为自身免疫性疾病的发病机制研究提供新的思路。方法1.免疫组织化学染色利用免疫组化试剂盒,对多器官组织芯片或裸鼠瘤体组织石蜡切片进行免疫组织化学染色,检测包括食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、肺癌在内的多器官肿瘤及癌旁组织和裸鼠皮下移植瘤组织中TIM-4的表达情况。2.RT-PCR收集人肺癌细胞系A549、H1299、H358、H1975、SPCA1、95D以及人单核细胞系THP1, Trizol提取总RNA,逆转录为cDNA作为模板,分别扩增TIM-4及actin mRNA。同法检测A549细胞中整合素亚基αV,β3mRNA的表达。3.载体构建以pcDNA3.0为骨架载体,以pcDNA3.0-hTIM-4为模板,构建携带HA标签的人TIM-4全基因表达载体pcDNA3.0-hTIM-4-HA,再以此全长载体为模板,构建IgV域RGD基序突变为AAA的hTIM-4突变载体pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA,以及PS结合位点第119、120、121、122位氨基酸全部突变为丙氨酸的突变载体pcDNA3.0-hTIM-4(119-122mutant)-HA,以PCR、双酶切、测序鉴定载体。4.CCK-8检测细胞增殖将pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA载体以脂质体转染的方式转入A549细胞,CCK-8法检测细胞增殖,读取OD450nm/630nm,绘制生长曲线；将人TIM-4三种小干扰RNA及对照分别转入A549细胞,同上检测细胞增殖、绘制生长曲线；pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA三种载体分别转入A549细胞,转染后5天,CCK-8检测细胞增殖。5.细胞周期检测pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA三种载体分别转染入A549细胞,48h后PI染色,流式细胞术检测细胞周期。同上转染小干扰及对照后检测细胞周期。6.凋亡检测pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(119-122mutant)HA转染A549细胞,24h后更换为不含血清的DMEM培养基,进行血清饥饿以诱导凋亡,48h后收集细胞进行Annexin/PI双标,流式细胞术检测细胞凋亡。7. Western Blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)、周期蛋白以及凋亡相关蛋白A549细胞转染pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA三种载体,转染48h后收蛋白,Western Blot检测PCNA、Cyclin A、CyclinB1、CyclinDl的表达。A549细胞转染pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(119-122mutant)-HA,同上检测Nur-77、PARP、 Bcl2、Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome c的表达。8.免疫共沉淀(Co-IP)A549细胞种于6孔板中,转染pcDNA3.0-hTIM-4-HA,48h后收蛋白,分别用HA和αVβ3的抗体沉淀蛋白,Western Blot检测HA和αVγ3,验证TIM-4和αVβ3可以相互结合。9.EdU免疫荧光检测细胞增殖A549细胞转染pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA三种载体,转染后第4天进行EdU检测,荧光显微镜下观察。10.裸鼠成瘤实验4-6w雄性BALB/c裸鼠,分为三组,皮下注射A549细胞,10d左右成瘤,待瘤体直径长至5mm左右时开始瘤内注射pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、 pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA三种质粒DNA,每间隔两天注射一次,每次注射前量取瘤体长和宽,绘制生长曲线。14d后处死小鼠,剥离瘤体并称量瘤重,拍摄瘤体照片,取少量肿瘤组织多聚甲醛固定,制作石蜡切片。11.SLE模型鼠的建立6-8w BALB/c雌性小鼠,腹腔注射pristane500μl,每月取血清测抗dsDNA抗体、ANA抗体,鉴定模型。12.Tim-4干预性处理小鼠腹腔注射pristine,1.5m后分为2组,分别尾静脉注射lentivirus Tim-4RNAi及Nc,同上每月检测尿蛋白,取血清采用ELISA方法检测抗dsDNA抗体、免疫荧光法检测ANA抗体,pristane注射11月后处死小鼠,取血清,取腹腔巨噬细胞计数,分离脾细胞进行流式检测,肾脏和肺组织OCT包埋,进行冰冻切片。13.免疫荧光稀释尾静脉血清,免疫荧光检测ANA；肾脏冰冻切片直接免疫荧光法标记IgG、C3抗体,检测肾脏免疫复合物沉积情况。14.流式细胞术检测MDSC、Treg脾脏研磨制成单细胞悬液,标记CD11b、Gr1检测MDSC;标记CD4、CD25、 Foxp3检测Treg。15.HE染色肾脏和肺冰冻切片进行HE染色,检测肾脏和肺部炎症损伤情况。结果1.TIM-4在多器官肿瘤组织芯片中的表达多器官肿瘤组织芯片免疫组化检测结果表明TIM-4表达于多种肿瘤组织,其中食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌组织中TIM-4的表达明显高于癌旁组织。2.LPS及细胞因子对TIM-4在肺癌细胞中表达的影响RT-PCR检测结果显示,多种肺癌细胞系A549、H1299、H358、H1975、 SPCA1、95D中都可检测到TIM-4mRNA的表达,但TIM-4表达水平较低；LPS、IL-6、TNF-α、TGF-β刺激可诱导TIM-4的表达。3.TIM-4对肺癌细胞的生长及增殖的影响人TIM-4真核表达载体转染A549细胞,利用CCK-8分别于不同时间点检测细胞的生长情况,结果显示TIM-4过表达组细胞生长速度显著高于空载体对照组,Western blot结果显示PCNA表达显著上调,经EdU染色,免疫荧光检测结果显示TIM-4过表达组细胞增殖显著高于对照组。与此相对应,干扰TIM-4后可显著抑制A549细胞的生长。4.TIM-4对肺癌细胞细胞周期的影响人TIM-4真核表达载体转染A549细胞,转染后48h收集细胞,PI染色、流式细胞术检测细胞周期。结果显示转染TIM-4后可明显促进A549细胞在S期累积,上调细胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin B1、Cyclin D1的表达；而转染TIM-4siRNA后抑制A549细胞在S期积累。5.TIM-4与αVβ3在A549细胞中的结合RT-PCR结果显示,A549细胞中可检测到α V、β3mRNA的表达,转染pcDNA3-hTIM-4-HA后分别以HA及αVβ3抗体进行Co-IP,结果显示外源性TIM-4可与αVβ3相互结合。6.TIM-4RGD基序突变对A549细胞生长、增殖及细胞周期进展的影响分别转染pcDNA3、pcDNA3-hTIM-4-HA、pcDNA3-hTIM-4(RGD-AAA)-HA,CCK-8、细胞周期、Western Blot、EdU免疫荧光检测结果显示,TIM-4促进A549细胞生长、增殖及促细胞周期进展的作用消失。7.TIM-4对Nur77表达及肺癌细胞凋亡的影响转染TIM-4后,Annexin-V/PI双标,流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示TIM-4过表达抑制A549细胞的凋亡,WesternBlot结果显示TIM-4转染组Nur77表达降低,Bc12表达升高,而PARP以及Cytochrome c降低。8.TIM-4PS结合位点突变对A549细胞凋亡的影响分别转染pcDNA3、pcDNA3-hTIM-4-HA、pcDNA3-hTIM-4(119-122mutant)-HA,Annexin-V/PI染色,流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果发现TIM-4PS结合位点突变载体抑制A549细胞凋亡的作用降低。9.TIM-4在体内对肺癌生长的影响利用A549细胞接种于裸鼠进行皮下成瘤,分别瘤内注射pcDNA3、pcDNA3-hTIM-4-HA、pcDNA3-hTIM-4(RGD-AAA)-HA质粒DNA,通过测量肿瘤体积、称瘤重,发现野生型TIM-4质粒注射组肿瘤生长速度明显快于空载体对照组,而RGD基序突变质粒注射组与对照组无显著性差异。免疫组织化学染色结果显示,pcDNA3-hTIM-4-HA.pcDNA3-hTIM-4(RGD-AAA)-HA质粒DNA注射组肿瘤组织中可检测到较高水平的TIM-4表达,野生型TIM-4注射组Ki67表达明显强于对照组,而RGD突变组与对照组无明显差异。10. Pristane诱导SLE小鼠模型的建立通过定期检测ANA抗体、抗dsDNA抗体证实小鼠SLE模型成功建立。Pristane腹腔注射后4周,腹腔中细胞数量明显增加,外周血ANA检测发现有不同的核型,包括均质型、核少点型、核膜型。11.Tim-4慢病毒干扰对dsDNA、ANA、血清免疫复合物的影响Tim-4慢病毒干扰组及对照组血清dsDNA、ANA无显著差别,血清循环免疫复合物检测结果也无明显差别。12.Tim-4干扰对肾脏IgG、C3免疫复合物沉积的影响肾脏免疫荧光检测结果显示,TIM-4慢病毒干扰组IgG、C3免疫复合物沉积明显多于对照组。13.Tim-4干扰对肾脏和肺损伤的影响肾脏、肺组织HE染色显示,Tim-4慢病毒干扰加重肾脏和肺部炎症损伤。14.Tim-4慢病毒干扰对腹腔巨噬细胞计数和脾脏MDSC、Treg的影响Tim-4慢病毒干扰组及对照组腹腔灌洗液巨噬细胞计数无差别,脾脏流式检测MDSC、Treg无差别。结论1.TIM-4可促进肺癌细胞的生长、增殖、细胞周期进展,抑制肺癌细胞的凋亡：2.TIM-4通过其IgV域RGD基序与整合素αVβ3相互结合促进肺癌细胞生长、增殖；3.TIM-4可能部分通过其PS结合位点抑制肺癌细胞凋亡,促进肺癌进展；4.TIM-4干扰加重SLE模型鼠肾脏免疫复合物沉积以及肾脏和肺部炎症损伤。创新点及意义本研究首次发现新型免疫分子TIM-4可促进肺癌生长增殖及周期进展,并发现TIM-4是通过其RGD基序与整合素αVβ3相互结合发挥其促进肺癌的进展,另外发现TIM-4促进肺癌进展可能与其抑制细胞凋亡有关,为肺癌预防、诊断及临床治疗提供新的候选靶点；另外,发现干扰TIM-4可加重SLE肾脏免疫复合物的沉积以及肾脏和肺部炎症,为SLE的发病机制研究提供新的思路。