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目的预测并验证miR-200a下游的靶基因,探索miR-200a通过调控上皮-间质转化(EMT)对结直肠癌侵袭和迁移的作用机制。方法1.通过四个预测micro RNA下游靶点的网站(Target Scan、miRanda、DIANA-Tar Base、Pic Tar)筛选miR-200a候选的下游靶点。2.构建miR-200a上调或下调的SW480和DLD1细胞系。q RT-PCR检测结直肠癌细胞中miR-200a对FOXA1 m RNA的作用。Western blot检测结直肠癌细胞中miR-200a对FOXA1蛋白的作用。荧光素酶报告(Luciferase)实验验证miR-200a是否能直接调控FOXA1的表达。3.收集60例来自湖北省十堰市太和医院经手术切除患者的结直肠癌组织及其对应的癌旁正常组织,q RT-PCR检测结直肠癌组织和癌旁正常组织中FOXA1 m RNA及miR-200a的表达水平,统计学方法分析结直肠癌组织和癌旁正常组织FOXA1 m RNA和miR-200a表达水平的相关性。4.q RT-PCR检测结直肠癌细胞SW480、DLD1和正常结肠上皮细胞NCM460中miR-200a的表达水平。在miR-200a上调或下调的SW480和DLD1细胞系中,平板克隆实验检测miR-200a对结直肠癌细胞的增殖作用。细胞划痕实验检测miR-200a对结直肠癌细胞的迁移作用。Transwell侵袭和迁移实验检测miR-200a对结直肠癌细胞侵袭和迁移的作用。Western blot检测miR-200a对结直肠癌细胞EMT相关蛋白的作用。结果1.通过四个预测miRNA下游靶点的网站筛选出FOXA1是miR-200a候选的下游靶点。2.q RT-PCR和Western blot结果显示SW480和DLD1细胞系miR-200a上调后,FOXA1 m RNA和FOXA1蛋白的表达水平均下降;miR-200a下调后FOXA1 m RNA和FOXA1蛋白的表达水平均升高。荧光素酶报告(Luciferase)实验验证miR-200a能直接靶向调控FOXA1的表达。3.q RT-PCR结果显示FOXA1 m RNA在结直肠癌组织中表达水平高于癌旁正常组织中表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-200a在结直肠癌组织中表达水平低于癌旁正常组织中表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示,在结直肠癌和癌旁组织中FOXA1 m RNA的表达水平和miR-200a的表达水平呈负相关(R~2=0.21,P=1.01E-07)。4.q RT-PCR结果显示在SW480、DLDl细胞系中miR-200a的表达水平低于NCM460细胞系,差异有统计学意义(P<0.05)。平板克隆实验,划痕实验,Transwell侵袭和迁移实验证实上调miR-200a抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移的能力,而下调miR-200a促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移的能力。Western blot结果表明,miR-200a的上调使结直肠癌细胞中N-钙粘蛋白、YAP1蛋白表达水平下降,E-钙粘蛋白表达水平上升。miR-200a的下调使结直肠癌细胞中N-钙粘蛋白、YAP1蛋白表达水平上升,E-钙粘蛋白表达水平下降。结论1.miRNA下游靶点的预测网站筛选出FOXA1是miR-200a候选的下游靶点。2.miR-200a上调的SW480和DLD1细胞系中,FOXA1 m RNA和蛋白的表达水平均下降;miR-200a下调后FOXA1 m RNA和FOXA1蛋白的表达水平均升高。荧光素酶报告(Luciferase)实验验证miR-200a能直接靶向调控FOXA1的表达。3.与癌旁正常组织相比,结直肠癌组织中miR-200a的表达水平下降,FOXA1 m RNA表达水平升高。在结直肠癌和癌旁组织中FOXA1 m RNA的表达水平和miR-200a的表达水平呈负相关。4.miR-200a通过抑制EMT从而抑制结直肠癌细胞的侵袭,迁移。