目的:神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）是一种发生在交感神经系统引起的胚胎性肿瘤,约占儿童癌症死亡率的15%。其临床表现多种多样,在低中风险组患者,常表现出自发性消退、分化和对手术及化疗的良好反应;而高风险组患者中的治疗效果差,即使采用手术、放化疗及干细胞移植等多种联合治疗措施,也会发生多灶转移和化疗耐药而导致疾病复发,治疗失败。因此,有必要为NB的诊断和治疗寻找新的有效靶点。MYCN是MYC原癌基因家族的成员,约有20%的NB患者肿瘤组织有MYCN扩增,而在高危患者中肿瘤组织出现MYCN扩增的比例达40-50%。MYCN是NB患者独立的预后判断因素。因此,研究MYCN靶向分子的作用及机制是探索治疗高危NB患者的重要途径。我们从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中下载GSE121529的基因数据集,对MYCN下游分子的深度挖掘。基因本体论和KEGG分析应用于筛选的DEGs,STRING数据库和Cytoscape软件用于构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和执行DEGs的模块分析,R2数据库用于预后分析。最后,通过WB实验进行了蛋白水平的验证,从DEGs中筛选出PIF1和SESN1进行了进一步研究。PIF1是一种多功能解旋酶,在维持基因组的稳定性方面起着重要作用。该基因编码一种DNA依赖的三磷酸腺苷（ATP）代谢酶,其功能为5’至3’DNA解旋酶。Gagou M等人通过si RNA敲除评估了PIF1在人类细胞中的功能,发现PIF1缺失通过诱导凋亡的方式降低了人类肿瘤（结肠癌和乳腺癌）细胞的存活,而正常细胞不受PIF1缺失的影响。研究表明,PIF1解旋酶可通过下调端粒酶TERT活性,促进宫颈癌细胞增殖,抑制细胞凋亡。此外,PIF1在应激过程中对卵巢癌和非霍奇金淋巴瘤细胞的存活起着调控作用。目前,针对PIF1在肿瘤中的研究相对较少,尤其在NB中尚无相关报道。SESN1是一类应激反应蛋白,具有多种生物学功能,被认为是代谢的重要调节者。其可以参与生理平衡的调节,抑制与代谢、凋亡和自噬相关的疾病进展,从而防止癌症的发生。研究表明,SESN1能在一定程度上拮抗上颌骨癌细胞对化疗的抵抗作用。此外,SESN1的表达与头颈部鳞癌患者的预后密切相关,而在儿童实体肿瘤NB中未见相关报道。本研究分别进行了PIF1和SESN1对NB的生物学行为影响的研究。研究方法:1、本研究使用3种具有不同生物学特性的神经母细胞瘤细胞系:AS,SY5Y和NGP。2、数据库挖掘与使用:通过生物信息学技术对GEO数据库中芯片数据集GSE121529进行分析;通过R2数据库对样本量为649的NB患者数据进行评估。3、Western blot:检测细胞或肿瘤组织中MYCN,PIF1和SESN1蛋白的表达。4、细胞划痕实验:检测不同处理后细胞的迁移变化。5、克隆形成实验:检测不同处理后细胞的克隆形成情况。6、细胞转染技术:将PIF1,SESN1的si RNA或SESN1的过表达质粒转染入NB细胞中,调节PIF1,SESN1的表达水平,进一步研究其功能。7、利用流式细胞仪进行细胞周期及凋亡的检测:不同处理条件下,NB细胞经碘化丙啶染液（PI）染色后进行细胞周期的检测;NB细胞经Annexin V/PI染色后进行细胞凋亡检测。8、利用Incu Cyte变焦活细胞成像系统动态观察不同处理条件下NB细胞融合率的变化。9、细胞活性的检测:NB细胞经不同处理,在实验终点利用CCK-8试剂盒检测细胞的存活情况。10、动物实验:将转染SESN1 si RNA的NB细胞（AS,NGP和SY5Y）接种在小鼠皮下,观察移植瘤的出现时间、移植瘤生长情况及小鼠的存活时间。11、统计学分析:通过Graph Pad 8对数据进行统计分析,P<0.05具有显著差异。结果:第一部分:生物信息学技术分析筛选核心基因1、差异表达基因（DEGs）的识别:在GSE121529的芯片数据中,共识别了194个DEGs,包括下调110个,上调84个。2、DEGs的GO和KEGG富集分析:对DEGs进行富集分析,共识别了403个GO富集项和144个KEGG富集项。3、核心基因PIF1和SESN1的筛选:从排名前五的上下调基因中筛选出了核心基因PIF1;根据核心网络基因的degree评分排序,筛选了核心基因SESN1。4、核心基因分析:R2数据库生存分析发现,PIF1和SESN1的表达与NB患者的预后密切相关,且PIF1和SESN1的表达与MYCN密切相关。5、PIF1和SESN1的表达受MYCN调控:在NB细胞中,MYCN对PIF1的表达具有正向调控作用,对SESN1的表达具有反向调控作用。第二部分:下调PIF1的表达水平对NB细胞生物学行为的影响在AS和BE2细胞中分别转染PIF1 si RNA下调PIF1的表达水平:1、利用CCK-8检测细胞的活性:与对照组比较,PIF1 si RNA转染组细胞活性降低可达16%（AS）和29%（BE2）,差异具有统计学意义;动态观察细胞融合率,也可见相似的结果。2、利用流式细胞仪对Annexin V/PI染色后细胞进行凋亡检测:与对照组比较,PIF1 si RNA转染组凋亡细胞数增加11.03%（AS）和20.47%（BE2）,差异具有统计学意义。3、利用划痕实验观察细胞迁移:与对照组比较,PIF1 si RNA转染组细胞的迁移速率降低43%（AS）和20%（BE2）,差异具有统计学意义。4、利用流式细胞仪对PI染色后细胞进行细胞周期检测:与对照组比较,PIF1si RNA转染组细胞处于G1期细胞的比例增加14.59%（AS）和9.25%（BE2）,差异具有统计学意义。第三部分:SESN1不同表达水平对NB细胞生物学行为的影响体外研究:在AS,SY5Y和NGP三个细胞系中分别转染SESN1 si RNA或SESN1过表达质粒,下调或上调SESN1的表达水平后:1、细胞增殖活性改变:与对照组比较,转染SESN1 si RNA 3天后细胞活性分别增加114%（AS）和111%（SY5Y）,NGP细胞活性有增加趋势,在延长至6天时升高24%,具有统计学差异;转染SESN1过表达质粒的细胞,在观察时间内细胞活性分别降低了10%（AS）、15%（SY5Y）和11%（NGP）,具有统计学差异。细胞融合率的动态观察和克隆形成实验也得到相似结果。2、细胞迁移改变:与对照组比较,转染SESN1 si RNA的细胞其迁移速率分别增加了25%（AS）和41%（SY5Y）,具有统计学差异;转染SESN1过表达质粒的细胞,其细胞迁移速率分别降低了14%（AS）和33%（SY5Y）,具有统计学差异。体内研究:将转染了SESN1 si RNA的AS,SY5Y和NGP细胞分别接种到小鼠皮下:1、移植瘤出现时间:与对照组比较,SESN1表达水平降低的移植瘤出现较早,所用时间分别缩短了31.4天（AS）、23.2天（SY5Y）和9.7天（NGP）,具有统计学差异。2、移植瘤生长:与对照组比较,SESN1表达水平降低的移植瘤生长较快,实验终点时小鼠的肿瘤体积分别是对照组的5.6倍（AS）、12.7倍（SY5Y）和3.4倍（NGP）,具有统计学差异。3、小鼠生存时间:与对照组比较,移植瘤中SESN1表达水平降低的小鼠存活时间缩短,中位生存时间分别比对照组缩短了26天（AS）、20天（SY5Y）和12天（NGP）,具有统计学差异。结论:1、利用已有数据库和生物信息学分析发现了具有潜在作用的关键分子。2、在NB细胞中下调PIF1的表达水平,可以抑制细胞活性、促进细胞凋亡、抑制细胞迁移并诱导细胞阻滞在细胞周期的G1期。3、在NB细胞中SESN1具有抑制细胞增殖和细胞迁移的作用。4、在小鼠的NB移植瘤中下调SESN1的表达水平,可以促进肿瘤的生长,缩短移植瘤小鼠的生存时间。