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背景炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）包括克罗恩病（Crohn’s disease,CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）,其中CD以慢性腹痛、腹泻、血便、发热、贫血、营养不良等为临床症状,同时可伴有肠瘘和肛周病变等肠外表现和并发症。近年来抗肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactor-alpha,TNF-α）单克隆抗体英夫利西单抗（Infliximab,IFX）已成为CD的一线治疗方案。虽然IFX可显著降低患者复发率,改善肠道内外临床表现,减少类固醇激素的使用,但IFX疗效的个体差异性大,在诱导缓解期及后续的维持治疗阶段均有失去应答引起疾病复发的可能。其中IFX的继发性失应答（Loss of response,LOR）指患者在诱导缓解阶段对IFX有应答,却在随后的数周至数月逐渐丧失响应。非编码RNA（noncoding RNAs,ncRNAs）是不具有编码蛋白质能力的RNA,占据人类基因组的绝大部分,它们以不同形式调控基因表达并参与各种生理功能和疾病的发生。LOR是十分棘手的临床问题,目前关于其详细的分子机制尤其是RNA表达水平上的研究较少。目的本研究从IFX治疗发生继发性失应答的患者的肠黏膜RNA表达谱入手,探究LOR与IFX应答良好的患者肠黏膜mRNA、lncRNA、circRNA表达的差异,通过KEGG通路和GO数据库以及PPI网络分析差异表达基因涉及的信号通路和生理功能,预测ceRNA网络,进一步对于LOR发生的机制进行深入探索,并且对衡量IFX疗效的生物标记物进行预测。方法1.患者筛选:LOR评估需要CD患者在曾经的IFX治疗中表现为有应答,且目前处于疾病复发状态（CDAI较基线值下降不足70分或总分≥150分）、内镜检查提示SES-CD评分≥3分、活检组织石蜡病理切片评估为中度或重度活动性。IFX应答良好（IFXR组）应满足:CDAI＜150分、SES-CD＜3分、组织病理切片评估为静止期。患者应未合并其他慢性炎性疾病、自身免疫性疾病以及肿瘤,目前仅使用IFX单药治疗,近6月内无手术史,且处于IFX维持治疗阶段（疗程＞14周）。2.提取活检组织的总RNA,构建DNA文库。根据DNA文库进一步制备与加载DNB和测序载片,选用DNBSEQ测序平台完成测序工作,测序长度PE100。3.对测序结果进行质控将过滤,得到洁净reads,将其比对到参考基因组和转录组上。计算基因表达量,本研究认为lncRNA与mRNA表达量FPKM＞1、circRNA表达量TPM＞1为基因有效表达。4.用SPSS 26.0软件统计患者基本信息,DESeq2计算IFXR与LOR两组的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,用 KEGG Pathway和 GO、STING、miRDB数据库获取DEGs相关信息,用R软件的pheatmap包、ggplot2包、pROC包、华大基因多组学系统、Cytoscape进行数据分析和绘图。5.对差异表达倍数较大的部分基因在GEO数据库中进行验证,预测它们是否可作为IFX疗效评估的生物标记物,并观察IFX治疗前后表达量的变化。结果1.有效表达基因中,差异表达mRNA共329个,198个在LOR组上调,下调131个;lncRNA共43个,32个上调表达基因,1 1个下调表达;circRNA共25 个,其中上调 1 7 个,下调 8 个。MMP1、CHI3L1、PRAP1、ALDOB、TNC、CXCL8、NLRP6、COL7A1、DPEP1、CEMIP是两组间差异表达倍数最大的前10个 mRNA。2.差异表达mRNA在GO-C数据库的质膜外侧、质膜、分泌膜颗粒、胞外区、细胞表面;在GO-F的抗原结合、IgG结合、蛋白同源二聚体活性、催化活性、MHC Ⅰb类蛋白复合物结合;在GO-P的免疫过程、炎症应答、细胞因子介导信号通路、免疫应答、中性粒细胞趋化等项目显著富集。在类风湿性关节炎、细胞因子及其受体相互作用、炎症性肠病等KEGG通路项目富集。3.将|log2FC|＞5的10个mRNA在miRDB数据库中按照预测分数＞80分和靶点＜800的标准,其中共有7个mRNA与12个miRNA可相互结合。进一步在华大基因多组学系统继续预测miRNA-lncRNA、miRNA-circRNA关联,在DEGs中共包括18个lncRNA、8个circRNA在预测的关联中。4.PPI 网络中的前 10 个 hub 基因为:TNF（degree=78）、IL-1B（degree=66）、CD86（degree=56）、TLR2（degree=53）、CXCL8（degree=50）、FCGR3B（degree=50）、CTLA4（degree=50）、SELL（degree=44）、FOXP3（degree=44）、IGTB2（degree=44）。前3个PPI功能模块的seed note基因分别为ITGAE、AMACR和ITGB2。5.在GSE16879数据库中进行验证,发现MMP1（AUC=0.904,cut-off值=952.750,灵敏度=1,特异度=0.789）;CHI3L1（AUC=0.904,cut-off值=81.717,灵敏度=0.824,特异度=0.947）:TNC（AUC=0.916,cut-off 值=46.050,灵敏度=0.941,特异度=0.737）;CXCL8（AUC=0.975,cut-off 值=283.575,灵敏度=1,特异度=0.947）;COL7A1（AUC=0.910,cut-off值=59.850,灵敏度=0.765,特异度=0.947）;CEMIP（AUC=0.929,cut-off值=37.200,灵敏度=0.882,特异度=0.895）具有较好的对IFX应答情况的预测效果。AUC＞0.9的6个mRNA在非应答组的治疗前表达水平高于应答组,且这些mRNA在应答组经IFX治疗后表达水平均下降,但非应答组治疗后除MMP1外均无显著下降。结论1.在IFX治疗的CD患者测序结果中,LOR组与IFXR组相比共有198个mRNA、32 个 lncRNA 和 17 个 circRNA 上调;131 个mRNA、11 个 lncRNA 和8个circRNA下调,两组的基因表达谱存在差异。2.MMP1、CHI3L1、PRAP1、ALDOB、TNC、CXCL8、NLRP6、COL7A1、DPEP1、CEMIP是组间差异表达倍数最大的10个mRNA,其中CXCL8被预测对IFX应答疗效诊断有重要价值。3.TNF是DE mRNA的PPI网络中连接度排名最高的节点,两组间RNA表达谱差异与TNF密切相关。