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猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种慢性接触性呼吸道病,并常诱发其它病原的感染引起死亡,给现代养猪业造成巨大损失。临床试验证明,疫苗接种是防治该病的有效手段,目前在我国进行产业化生产并广泛使用的是由江苏省农业科学院兽医研究所于2007年成功研制的猪Mhp168株弱毒疫苗,但Mhp168株活疫苗采用的肺内免疫途径不利于推广利用,目前,气溶胶疫苗已经成为一种不需要打针、接种量大且有效的免疫方式。在2013年,江苏省农科院兽医所报道了猪肺炎支原体气溶胶疫苗的研制,且动物试验证明能成功接种至猪的呼吸道末端,然而,对于其安全性和免疫剂量仍待进一步研究。据文献报道,一种新型的气液交界面暴露系统可评估气溶胶纳米分子的毒性,其优点是一方面真实地模拟了体内气溶胶免疫过程,另一方面保证了纳米分子真正的生物学特性。因此,本课题采用了这种新型的气液交界面(ALI)培养系统,评估猪肺炎支原体气溶胶疫苗的安全性。本研究通过优化猪传代气管上皮细胞系(STEC)的气液交界面(ALI)培养时间及培养基中血清浓度和辅助因子,发现细胞培养基血清浓度维持在10%,且在细胞分化时,添加15ng/mL视黄酸培养至第10 d时,STEC微绒毛分化状态最佳,成功建立了 ALI培养的猪传代气管上皮系3D模型,之后进行猪肺炎支原体气溶胶疫苗的安全性评估试验,主要分为以下两个部分:1 猪肺炎支原体不同毒力菌株对猪气管上皮3D细胞的损伤差异与机制分析本试验将相同剂量的Mhp强毒株NJ株、中等毒力菌株AH株和弱毒株168L株分别感染3D培养的STEC,分别通过单层细胞跨膜电阻检测、Alamar Blue检测、乳酸脱氢酶(LDH)释放检测等试验测定细胞单层完整性与细胞活性,并通过激光共聚焦和荧光分光光度计测定感染后48 h的细胞MUC5B黏液蛋白的分泌量;还从细胞氧化系统方面,比较检测各感染组细胞内NO和内源性ROS分泌量,进一步探索Mhp的致病机制。结果如下:(1)强毒株NJ株和中等毒力AH株组微绒毛有明显的变粗、破损和脱落现象,而弱毒株168L株组对微绒毛的影响较小;Mhp菌株感染后细胞单层跨膜电阻显著下降,且电阻下降程度与菌株毒力呈正相关。(2)Alamar Blue检测试验、乳酸脱氢酶释放检测结果均表明,Mhp NJ株与AH株感染后均可以显著降低细胞活性,且在感染后48 h最明显。Mhp菌株感染后还可促进细胞分泌MUC5B黏蛋白,菌株毒力越强,刺激黏蛋白分泌的量也越多。(3)氧化应激检测结果显示,除Mhp弱毒菌株168L外,中等毒力菌株AH株和强毒株NJ株感染3D分化的STEC细胞后,可显著刺激细胞分泌NO和内源性ROS,显著引起细胞的氧化应激反应。而经ROS抑制剂(NAC)处理后,强毒株NJ株、中等毒力AH株和弱毒株168L株组细胞ROS和黏液分泌量均显著降低,细胞活性和电阻值均显著升高。(4)以上结果表明,Mhp感染可影响宿主细胞的生长特性、活性与功能,损伤分化的微绒毛,其损伤的能力与菌株毒力呈正相关;而这种损伤机制与Mhp菌株引起感染细胞氧化应激的能力密切相关。2 基于3D细胞培养技术评估气溶胶接种方式的安全性本试验首先建立和优化猪肺炎支原体气溶胶疫苗体外评估的气溶胶喷雾装置,将相同剂量的猪肺炎支原体168弱毒菌株分别通过气溶胶方式和滴加方式接种3D培养的猪气管上皮细胞,分别通过单层细胞跨膜电阻检测、Alamar Blue检测、乳酸脱氢酶释放检测等试验测定接种3 h、48h后细胞单层完整性与细胞活性,并通过激光共聚焦和荧光分光光度计测定感染3 h、48 h的细胞MUC5B黏液蛋白分泌量,从细胞生长特性、活性和黏液分泌功能方面比较不同接种方式的Mhp168弱毒菌株对STEC分化细胞的影响,并从氧化损伤和炎性因子分泌角度,比较不同接种组细胞内源性ROS释放水平和促炎因子(IL-6、TNF-α和IL-1β)分泌量,进一步探究其致病机制。结果如下:(1)扫描电镜观察,滴加疫苗组接种3 h和48 h后STEC微绒毛状态均与对照组无明显差异,而气溶胶稀释剂和疫苗组接种3 h后微绒毛均有轻微的变粗和聚集现象,但随着接种后孵育时间延长至48 h,气溶胶稀释剂和疫苗组微绒毛生长状态逐渐恢复。(2)单层跨膜电阻值和Alamar Blue、乳酸脱氢酶释放检测细胞活性结果均显示,与ALI组相比,滴加疫苗组接种后细胞活性和生长特性均下无明显下降,而气溶胶稀释剂组和疫苗组接种3 h后可显著降低细胞活性和生长特性,但随着接种时间延长至48 h,其细胞活性和生长特性又有一定程度的恢复。黏液蛋白分泌功能检测结果表明,与ALI组相比,滴加疫苗组接种后黏液蛋白分泌量无明显上调,而气溶胶稀释剂和疫苗组接种3 h后黏液蛋白分泌量显著上调,但随着接种时间的延长至48 h,其黏液蛋白分泌量又逐渐恢复。(3)细胞内源性ROS释放和促炎因子分泌检测结果均表明,各接种组STEC内源性ROS释放水平和促炎因子(IL-6、TNF-α和IL-1β)分泌量的变化趋势均与各接种组的生长特性、活性和黏液分泌功能变化趋势一致,这表明气溶胶接种对STEC产生的急性损伤可能与氧化应激和炎性因子分泌密切相关。可明确的是,这种急性损伤并不是来自于疫苗株,但是否来源于气溶胶颗粒本身,或者接种模型中细胞表面产生过强人造气流造成的非特异性损伤,尚不清楚。