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研究目的:建立激光诱导CNV大鼠模型,研究蒙药明目-11治疗齐苏希拉性年龄相关性黄斑变性的机制,为该药治疗齐苏希拉性年龄相关性黄斑变性提供实验依据。研究内容与研究方法:1.对蒙药明目-11(MM-11)进行方源、方解及其临床应用分析,为进一步开发利用提供科学依据。2.为观察蒙药明目-11联合康柏西普治疗齐苏希拉性年龄相关性黄斑变性(w AMD)的短期疗效,前瞻性纳入2018年1月—2019年6月内蒙古民族大学附属医院眼科68例(68只眼)w AMD患者,按入院时间顺序随机分联合用药组和单纯用康柏西普组,全部患者入组后行一次玻璃体腔内注射康柏西普0.5m L。蒙药明目-11联合康柏西普组口服明目-11、日2次、一次13粒、3周为一个疗程、每月服用一个疗程,全部患者首次注射前及注射后1、3个月,检查术眼最佳矫正视力(BCVA)、黄斑中心凹厚度(CMT)、脉络膜新生血管(CNV)面积,评估蒙药明目-11的疗效。3.应用明目-11对激光诱导CNV大鼠模型进行灌胃给药,通过形态学和分子生物学检测,评价其对脉络膜新生血管的抑制作用。BN(Brown Norway)大鼠120只(体重130-150g),按体重随机分成6组:空白组、模型组、明目-11低剂量给药组、中剂量给药组、高剂量给药组,阳性对照组,阳性对照组即低剂量给药组+康柏西普组。应用532nm激光光凝仪距视乳头2-3PD外围绕视乳头于两支血管之间每眼光凝8个点。光斑能量输出功率150-200mw,直径50um,曝光时间0.1s。造模后第1天开始给药,第21天行眼底荧光素血管造影(FFA)、光学相干断层扫描检查(OCT)后腹主动脉取血、处死。进行Elisa分析脉络膜新生血管(CNV)相关蛋白表达量,HE染色检测CNV渗漏面积及CNV厚度。4.对脉络膜微血管内皮细胞(CECs)氧化应激模型进行培养,观察蒙药明目-11含药血清、人工胃液提取物及从网络药理学筛选的该药11种活性成分抑制脉络膜新生血管的能力,筛选其活性作用显著的成分,并从细胞水平评价其对CNV的抑制作用。采用MTT法检测CEC细胞抑制率;采用Matrigel胶检测CEC细胞管道形成能力。5.采用转录组学的RNA-seq测序技术,研究藏花醛对CEC细胞血管形成的抑制机制。从RNA水平研究药物特征差异表达基因及其信号通路,为蒙药明目-11的功能分析提供数据支持。同时利用Western bloting技术验证该差异基因富集的通路。结果:1.明目-11出自《内蒙古蒙药制剂规范》,属传统方。由诃子、西红花、人工牛黄、丁香、手参、滑石、赭石(制)、熊胆粉、朱砂、白硇砂、姜黄组成,其藏花醛、姜黄素、没食子酸等活性成分有治疗黄斑变性作用。功能清肝热、明目。对齐苏希拉性眼疾、昏朦、目赤、翳障及干性结膜炎疗效显著。临床疗效确切,对眼底出血的治疗效果显著。2.蒙药明目-11和抗VEGF药物能明显提高齐苏希拉性AMD患者的视力,保护视功能;蒙药明目-11联合抗VEGF药物能够促进出血吸收,减少黄斑区CNV面积,疗效优于单纯抗VEGF药物治疗;蒙药明目-11联合抗VEGF治疗齐苏希拉性AMD是安全有效的;联合蒙药治疗能够减少齐苏希拉性AMD的治疗次数、提高抑制新生血管的有效性、持续性,同时改善视功能。3.激光诱导BN大鼠CNV模型成功后FFA检测荧光渗漏面积及HE染色测量CNV厚度结果:(1)模型组与各治疗组相比有显著性差异,P<0.05,有统计学意义。(2)明目-11中剂量治疗组和阳性对照组间无显著性差异,P>0.05,两组治疗CNV相比无显著性差异,P>0.05;阳性对照组和明目-11中剂量组与低剂量治疗组和高剂量治疗组相比有显著性差异,P<0.05,有统计学意义。(3)明目-11低、高剂量组间无显著性差异,P>0.05,无统计学意义。酶联免疫分析法(ELISA)检测VEGF-165及整合素α6β1在血清中的表达结果表明:(1)空白组与其他各组间对比VEGF-165含量均有显著性差异,P<0.05;模型组与各治疗组间有显著性差异P<0.05;(2)MM-11中剂量组与阳性对照组间无显著性差异,P>0.05。(3)MM-11中剂量组和阳性对照组与明目-11低剂量组和高剂量组间有显著性差异,P<0.05。酶联免疫分析法(ELISA)检测整合素α6β1含量在空白组与模型组,模型组与中、高、阳性对照组之间有显著性差异,P<0.05。各治疗组间对比:低剂量组和阳性对照组,高剂量组和阳性对照组间有显著性差异,P<0.05;中剂量组和阳性对照组间无显著性差异,P>0.05。4.制作脉络膜微血管内皮细胞氧化应激模型,对含明目-11血清、明目-11人工胃液提取物及筛选的11种活性药物进行MTT法检测,观察对CEC细胞抑制率结果:明目-11人工胃液提取物及藏花醛随药物浓度增长抑制率明显增长;应用Matrigel胶检测CEC细胞管道形成能力结果:血管生成诱导前,藏花醛对细胞的增殖及长势无影响,各组细胞形态、密度长势趋于一致;血管生成诱导后藏花醛随其剂量增加,呈现剂量依存的抑制血管生成效应。5.采用转录组学的RNA-seq测序技术,研究藏花醛对CEC细胞血管形成的抑制机制。从RNA水平研究药物特征表达基因结果:筛选药物组和模型组差异表达的m RNA表达谱分析,结果表明,药物组与模型组比较,共有314个m RNA,其中上调145个,下调169个。筛选模型组与对照组和药物组和模型组共有的m RNA,GO功能分析结果表明,GO的分子功能富集到66个term,细胞组分富集到75个term,生物学途径富集到411个term。KEGG通路富集分析差异基因可能参与的通路,共富集到7条通路。与AMD疾病的发生发展相关的通路有PI3K/Akt通路和FOXO通路。对差异表达基因富集的通路进行western blot验证结果确定了IRS-PI3K-PDK1/2-AKT-BAD信号通路,即IRS-PI3K-PDK信号通路,其中,这条通路中的原件,顺序为逐级磷酸化激活的关系,最终将细胞走向诱导为BAD介导的凋亡信号通路,并western blot验证后证明了明目-11可以调控该通路并治疗AMD。结论:1.明目-11出自《内蒙古蒙药制剂规范》,属传统方。由诃子、西红花、人工牛黄、丁香、手参、滑石、赭石(制)、熊胆粉、朱砂、白硇砂、姜黄组成。功能清肝热、明目。临床疗效确切,对眼底出血的治疗效果显著。2.蒙药明目-11和抗VEGF药物均能明显提高齐苏希拉性AMD患者的视力,保护患者的视功能;蒙药明目-11联合抗VEGF药物治疗比单纯抗VEGF药物能明显减少齐苏希拉性AMD的治疗次数、提高抑制新生血管的有效性、持续性、同时改善视功能。3.激光诱导BN大鼠CNV模型成功,并检测荧光渗漏面积及HE染色测量CNV厚度结果表明,明目-11中剂量组和阳性对照组对视网膜渗漏有明显的吸收作用。酶联免疫分析法(ELISA)检测VEGF-165及整合素α6β1在血清中的表达量结果表明,明目-11及阳性对照药物对CNV的治疗有显效,VEGF-165及整合素α6β1参与了细胞生长及其病理过程、对细胞迁移、新生血管形成有重要作用。4.应用MTT法检测结果:明目-11人工胃液提取物及活性成分藏花醛明显抑制CEC细胞增殖。Matrigel胶检测CEC细胞管道形成能力结果:血管生成诱导前,藏花醛对细胞的增殖及长势无影响;血管生成诱导后藏花醛随其剂量增加,呈现剂量依存的抑制血管生成效应。5.采用转录组学技术从RNA水平研究藏花醛对CEC细胞血管形成的抑制机制,并对其进行KEGG通路富集分析找出差异基因可能参与的IRS-PI3K-PDK信号通路,再对该通路进行western bloting验证,证明明目-11可以调控该通路并治疗AMD。为蒙药明目-11治疗齐苏希拉性黄斑变性及眼底新生血管性疾病的治疗提供了实验依据。