研究目的龟甲(Testudinis Carapax et Plastrum)来源于龟科动物乌龟 Chinemys reevesii(Gray)的背甲及腹甲,药用历史悠久,常以龟甲饮片、醋制龟甲、龟甲胶等形式入药,需求量大。龟甲胶(Testudinis Carapacis et Plastri Colla)由龟甲经水煎煮、浓缩制成,是我国特有的补益类中药之一。为了控制龟甲、龟甲胶掺假掺伪现象的发生,弥补龟甲、龟甲胶现有鉴别方法的不足,本实验对龟甲及其混伪品的性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱鉴别进行了客观系统的分析,并采用柱前衍生化HPLC法和电子鼻气味识别技术分别对龟甲及其混伪品、市售龟甲、市售龟甲胶样品的氨基酸种类、含量、比值和气味等进行了分析和鉴别。该研究所得的氨基酸比值评价指标和电子鼻气味判别模型适用于药材碎片、粉末的鉴别,对龟甲、龟甲胶的质量评价均有一定的指导意义,从而为龟甲、龟甲胶质量评价体系的完善提供了参考。研究方法1样品收集与性状鉴别、显微鉴别本研究共收集到12种龟类原动物,经处理得到44批龟甲样品,其中正品龟甲22批,龟甲混伪品22批。另外收集到市售龟甲19批和市售龟甲胶24批。对这些样品进行性状鉴别、显微鉴别,将其特征进行描述并拍照记录。2龟甲类样品的薄层色谱鉴别按照2015年版《中国药典》法,以胆固醇为对照品,对12种龟类甲壳的上下甲分别进行薄层色谱(TLC)鉴别,观察其差异。同法,对市售龟甲进行TLC检测。3建立龟甲、龟甲胶样品中氨基酸的AQC柱前衍生化HPLC测定方法对样品的水解时间、脱磷、脱钙条件、氨基酸的含量计算等进行考察,确定最佳实验条件。运用主成分分析(PCA)、聚类分析等多元统计方法,分别分析龟甲及其混伪品、市售龟甲、市售龟甲胶中不同氨基酸的含量或比值差异。4建立龟甲、龟甲胶的电子鼻判别模型分别对龟甲、龟甲胶样品的称样量、进样量、孵化温度、孵化时间、粉碎粒度等5个因素进行单因素考察和正交试验,确定龟甲、龟甲胶的最佳检测条件。通过测试集和训练集的验证,建立龟甲的判别因子分析(DFA)模型,并用该模型对市售龟甲进行质量评价。另外,运用DFA分析法对市售龟甲胶进行质量评价。研究结果1正品龟甲与其它多数龟类样品在性状上区别明显,主要表现在背甲和腹甲的颜色、盾片的特征等。市售龟甲胶性状特征主要体现在颜色、质地、断面等,但差异较小。所有龟类样品的显微特征均有骨质碎片和角质碎片,区别较小,还不能将其准确用于龟类品种鉴别。2薄层鉴别结果显示,在Rf值0.50左右,每份样品均出现与对照品胆固醇颜色相同的斑点,说明该12种龟类样品均含有胆固醇;此外,黄喉拟水龟的上下甲均在Rf值0.20左右,出现两个蓝色斑点,其它样品仅出现一个斑点或不明显,据此可将黄喉拟水龟甲鉴别出来。对市售龟甲药材的TLC检测发现,其均出现与对照品颜色相同的斑点,且没有黄喉拟水龟甲。3检测样品中氨基酸的前处理条件:O.1g的龟甲粉末需水解8h,70%乙醇20mL脱磷,0.1 mol·L-1的草酸8mL脱钙;0.05g的龟甲胶需水解8h,70%乙醇20mL脱磷,0.1 mol·L-1的草酸6mL脱钙。对氨基酸的种类和含量综合分析发现,龟甲的上、下甲中氨基酸的含量有差异,通过PCA分析法可将其区分开。除黄喉拟水龟外,根据正品龟甲甘氨酸(Gly)/脯氨酸(Pro)的比值范围1.763～1.854和Gly/苏氨酸(Thr)的比值范围5.372～7.729可将其余混伪品鉴别开来;其鉴别率达90.91%。该法对市售龟甲样品进行鉴别,正品龟甲占73.68%。市售龟甲胶样品中羟脯氨酸(Hyp)、Gly、丙氨酸(Ala)、Pro的含量几乎均符合2015版《中国药典》规定;通过聚类分析可将市售龟甲胶主要分成两大类,而Gly/精氨酸(Arg)的比值 2.78～2.88、Gly/Ala 比值 2.28～2.39、Gly/Pro 比值 1.84～1.90 中任一个与 Gly/Hyp的比值范围2.62～2.85相结合,其鉴别结果与聚类结果一致,说明氨基酸比值法同样适用于龟甲胶的质量分析。4龟甲的最佳检测条件为称样量0.3g、孵化温度55℃、进样量2000μL、粉碎粒度3号筛、孵化时间300s;龟甲胶的最佳检测条件为称样量0.6g、进样量2500μL、孵化温度70℃、粉碎粒度3号筛、孵化时间1200s。通过测试集和训练集的验证,龟甲正品与混伪品建立的DFA判别模型判别效果较好。对龟甲胶样品建立的拟正品组和拟伪品组建立的DFA判别模型同样可将二者区分开。说明电子鼻气味识别技术对龟甲及其混伪品、市售龟甲胶具有一定的判别能力。结论1采用薄层色谱法,可以鉴别出龟甲混伪品中的黄喉拟水龟甲。2 AQC柱前衍生化HPLC法能够用于检测龟甲、龟甲胶中的氨基酸种类和含量。氨基酸比值法,可以鉴别龟甲及其混伪品;可以初步评价市售龟甲胶的质量。3电子鼻气味识别技术能够对龟甲及其混伪品的气味进行识别并初步评价龟甲胶药材质量。创新点首次采用AQC柱前衍生化HPLC法测定龟甲及其混伪品中16种氨基酸的含量。该方法所得衍生化样品稳定,检测效率高。首次运用氨基酸比值法鉴别龟甲及其混伪品、龟甲胶样品。氨基酸比值法与薄层色谱法相结合,能较好地鉴别出龟甲及其它11种混伪品。首次采用电子鼻气味识别技术鉴别龟甲及其混伪品,该法能够较好地鉴别开龟甲与其混伪品。