猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）感染仔猪会发生猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）,这是一种以呕吐、严重腹泻为主要特征的高度接触性消化道传染病。该病主要感染2周龄以内的哺乳仔猪,致死率极高（可达100%）,给世界养猪业的健康发展带来了严重的损失。TGEV感染小肠上皮细胞后能造成细胞电解质转运功能障碍,肠腔渗透压改变,引起腹泻和脱水。目前有关TGEV引发仔猪腹泻的分子致病机制尚未完全阐明。肠道腹泻主要与小肠上皮细胞刷状缘膜Na⁺/H⁺交换蛋白NHE3转运Na⁺的功能密切相关。课题组前期研究表明,表皮生长因子受体（EGFR）可能参与小肠上皮细胞刷状缘NHE3的表达调控,又已知EGFR作为TGEV的受体有利于病毒入侵宿主细胞。TGEV感染的细胞内,能否通过改变EGFR表达进而调控NHE3活性,影响小肠上皮细胞对Na⁺的吸收,该疑问目前尚未解答。为证明以上假设,本研究建立猪小肠上皮细胞模型,感染TGEV后,检测小肠上皮细胞吸收Na⁺的浓度变化及NHE3的表达,采用EGFR抑制剂（AG1478）抑制EGFR后,检测EGFR/ERK信号通路中关键蛋白的表达与磷酸化水平,运用荧光漂白恢复和激光共聚焦等技术检测小肠上皮细胞质膜上NHE3的动态变化,分析TGEV感染小肠上皮细胞通过EGFR调控NHE3活性的机制,为阐明TGEV感染引发仔猪腹泻的致病机制研究提供理论依据。主要研究内容如下:1.TGEV感染IPEC-J2细胞对NHE3活性和表达的影响TGEV Miller株感染小肠上皮细胞（IPEC-J2）后,利用火焰型原子吸收光谱法测定感染不同时间点细胞内外Na⁺的浓度变化;发现TGEV感染细胞后,胞外Na⁺浓度逐渐升高,胞内Na⁺浓度先升高后降低;荧光定量PCR和Western-blot方法检测发现TGEV感染不同时间肠上皮细胞能下调NHE3 mRNA和蛋白相对表达量,说明TGEV感染IPEC-J2细胞后会导致细胞对Na⁺吸收功能和NHE3表达水平下降,NHE3的活性和表达均受到影响。2.TGEV感染IPEC-J2细胞通过EGFR/ERK通路调控NHE3的表达（1）采用Western-blot方法检测发现TGEV感染IPEC-J2细胞后,EGFR的磷酸化水平升高,MTT法检测结果表明30μM是AG1478作用IPEC-J2细胞的最大无毒剂量。（2）AG1478和DMSO分别作用IPEC-J2细胞后感染TGEV,采用TCID₅₀法测定病毒滴度,分析TGEV在细胞内的增殖能力;火焰原子吸收法测定细胞Na⁺浓度。结果表明,DMSO组的病毒滴度比对照组降低了32.5%、AG1478组的病毒滴度比DMSO组降低了93.3%;抑制EGFR后感染TGEV的细胞对Na⁺吸收能力高于只感染TGEV组。抑制EGFR后接种TGEV,相比对照组,TGEV感染组EGFR、ERK的磷酸化水平升高,NHE3蛋白表达量降低,差异性极显著（p<0.01）;相比TGEV感染组,AG1478处理后感染TGEV组EGFR、ERK的磷酸化被抑制,NHE3的表达量明显增加（0.01<p<0.05）。以上结果表明抑制EGFR后能阻碍TGEV在胞内的增殖,促进TGEV感染的细胞对Na⁺的吸收;抑制EGFR后感染TGEV能增强NHE3的活性和表达。3.EGFR介导TGEV感染IPEC-J2细胞调控NHE3流动性的研究根据NCBI中GenBank（XM₀21077062.1）已注册的NHE3 CDS区序列,人工合成NHE3基因片段,连接到哺乳动物真核表达载体pEGFP-N3以构建重组表达载体pEGFP-NHE3。将重组质粒转染至IPEC-J2细胞中,观察质粒的稳定表达周期。对AG1478处理组和只转染pEGFP-NHE3组同时接种TGEV,采用荧光漂白恢复技术（FRAP）检测NHE3在膜上的荧光漂白恢复率和动态分数（M_f）,分析膜蛋白NHE3流动性。相比未感染组,TGEV感染组NHE3的流动性显著减弱（p<0.01）,抑制EGFR后感染TGEV组NHE3的流动性比TGEV感染组强（0.01<p<0.05）,结果表明,该重组质粒在IPEC-J2细胞内的稳定表达周期约为5天,抑制EGFR后感染TGEV有利于恢复质膜上NHE3的流动性。