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荧光共振能量转移(FRET)作为重要的光物理技术已广泛应用于生物大分子之间距离的定性、定量检测,在蛋白质、核酸、细胞器结构功能研究,免疫分析,高分子和超分子科学,自由基、金属离子及糖类测定等领域都有巧妙而有效的应用。FRET也称为非辐射能量转移,即处于激发态的物种以偶极-偶极相互作用形式将激发能转移给处于基态的物种,传递距离在20~80 ?之间。其中,能量给予者为供体(donor),能量接受者为受体(acceptor),受体可发射自己的特征荧光(荧光增强),也可不发荧光(荧光猝灭)。荧光素量子产率高,是最常用的供体分子。镧系元素铕作为荧光标记的能量供体,量子产率高、荧光寿命长、发射峰窄,其准确性和信噪比大大提高。不产生荧光的受体其优势在于能够减少可能由受体本身直接产生的荧光背景的干扰。纳米金良好的稳定性、小尺寸效应、表面效应、光学效应、特殊的生物亲和效应,以及对荧光试剂高的猝灭效率,提高了FRET过程的灵敏度和特异性,使其成为一个研究和应用的热点。本论文基于FRET原理,设计、研制纳米金复合体系的荧光探针应用于生物活性物质的检测,开展了三方面的研究:(一)基于FRET原理,建立纳米金-DNA-荧光素复合体系专一性识别活细胞内羟自由基的新方法。纳米金具有高消光系数,在纳米金-荧光素组成的FRET供受体对中发挥突出的荧光猝灭作用。羟自由基引起DNA链断裂导致FRET现象消失,纳米金猝灭荧光素的荧光随之得到恢复,据此实现羟自由基的测定。方法的线性范围为8.0 nM~1.0μM,检测限为2.4 nM。小鼠腹腔巨噬细胞及HepG2人肝癌细胞内羟自由基的荧光成像实验表明:探针具有膜穿透性,并选择性捕获细胞内的羟自由基,对细胞内微摩尔级羟自由基含量的变化产生响应,表现了良好的生物适用性。(二)基于FRET原理,构建荧光化学传感器纳米金-β-环糊精(CDs)-荧光素超分子主体化合物识别客体分子胆固醇。纳米金经β-CDs修饰,通过β-CDs的包结作用使荧光素靠近纳米金,FRET现象发生,荧光素的荧光猝灭;竞争性的客体分子胆固醇存在时,挤占β-CDs的空腔与其形成更加稳定的包合物,荧光素远离纳米金,FRET难以发生,荧光素的荧光随之得到恢复。胆固醇浓度在30 nM~15μM范围内与荧光信号强度成线性关系,传感器的检测下限为9.0 nM。方法应用于血清样中胆固醇含量的测定,结果令人满意。(三)基于FRET原理,建立纳米金-肽-铕螯合物复合体系特异性检测Ⅳ型胶原酶活性的新方法。纳米金具有高消光系数,在纳米金-铕螯合物构成的FRET供受体对中发挥突出的荧光猝灭作用。Ⅳ型胶原酶水解肽链断裂导致FRET现象消失,纳米金猝灭铕螯合物的荧光随之得到恢复,据此实现Ⅳ型胶原酶的测定。方法的线性范围为0.1~5.0μg/mL,检测限为5.76 ng/mL。鉴于恶性表型和侵袭转移表型的细胞均表达Ⅳ型胶原酶高水平,预计本方法可用于评价癌变细胞恶性程度。