血栓栓塞是多种心血管疾病的主要发病原因之一。目前,已有多种溶栓制剂如组织型纤溶酶原激活剂、链激酶、尿激酶及其突变体等被用于治疗血栓性疾病,它们能有效降低病人的致死率和致残率。但是,目前的溶栓剂仍存在着再通不完全、初始再灌注延迟、血栓再形成、出血和过敏反应等缺陷。葡激酶(Staphylokinase,Sak)具有与组织型纤溶酶原激活剂相当的溶栓活性,并有更高的纤维蛋白专一性,能以大肠杆菌为宿主大量制备,是一种很有应用前景的溶栓剂。血小板聚集在血栓形成中起重要作用。血小板聚集依赖于特有的功能性受体 GPIIb/IIIa。国内外根据 Arg-Gly-Asp 三肽序列已设计了许多 GPIIb/IIIa受体阻断剂,用于抑制血小板聚集。 为研制兼具溶栓和防栓功能的低免疫原性新型溶栓剂,以降低溶栓后再栓发生率,根据葡激酶单体、微小纤溶酶?葡激酶?微小纤溶酶三元复合物的晶体结构,运用计算机辅助分子模拟技术并结合功能信息合理设计了新型的葡激酶突变体分子,在 Sak 分子的合理位置引入了 RGD 序列。以野生型 Sak 基因为模板,通过 PCR 获得突变基因,测序证实后与大肠杆菌表达载体 pLY-4 重组并转化大肠杆菌 JF1125 获得工程菌。纯化工程菌表达的突变体蛋白并检测其纤溶活性、酶动力学常数、抑制血小板聚集活性和免疫原性,结果显示,突变体 DGR和 RL1 具有与野生型 Sak 相当的纤溶活性,能显著抑制血小板的聚集,且免疫原性显著降低。 在已获得的新型重组葡激酶突变体 DGR 高效表达菌的基础上,初步建立了快速、简便、高效的中试工艺。采用低密度发酵,每升培液可收获湿菌 8 g,表达水平在 60%以上。菌体破胞后经超滤浓缩,凝胶过滤和离子交换层析二步纯化即可获得纯度为 97%以上,比活性 11.5×104 HU/mg 的 r-DGR 半成品,产率达 290 mg/L 培液。DGR 分子量为 15,455,等电点为 pH 6.6。 应用兔股动脉血栓模型,进行 DGR 的药效学研究,以评价 DGR 在体内的溶栓、防栓、抗血小板聚集作用及对血液凝血纤溶功能的影响,并与野生型 Sak比较。新西兰白兔 21 只,在远端狭窄和内皮损伤的股动脉注入凝血酶诱导血栓形成,分生理盐水组(n=3)、r-Sak 组(0.3 mg/kg,n=6)、DGR 低剂量组(0.15mg/kg,n=6)和 DGR 高剂量组(0.3 mg/kg,n=6)给药。全药量分 4 次经耳缘静脉推注,每次间隔 10min。给药后连续观察股动脉血流量 2 h,于给药前, 1<WP=5>博士论文 摘要给药后 60min,120min 采血测定血小板聚集率及凝血和纤溶指标。结果显示,0.15 mg/kg 的 DGR 与 0.3mg/kg 的 r-Sak 的溶栓效率相当,0.3mg/kg 的 DGR 取得初次再通时间较 r-Sak 缩短了一半,同时总开放时间延长。r-Sak 组再栓发生率为 50%(3/6),而 DGR 高低剂量组均未见再栓(0/6)。给药后 60min 和 120min,DGR 高剂量组血小板聚集率分别下降了 30%和 20%,DGR 低剂量组下降了 21%和 14%, 而生理盐水组和 r-Sak 组无显著变化。给药后各组的 TT、PT、aPTT和 Fg 均无显著变化。以上结果提示 DGR 能快速高效溶栓和抑制血小板聚集,有一定的防栓作用,而且不影响系统的凝血功能。