研究背景与研究目的血小板减少症是临床常见的放疗剂量、化疗药物剂量限制性毒性反应,可导致降低放疗剂量、化疗药物剂量或延迟放化疗时间,甚至终止放化疗。此外,血小板减少症还见于免疫性血小板减少、骨髓增生异常综合征及造血干细胞移植术后。血小板重度减少时可引起致命性出血而导致患者死亡,由此影响患者的临床疗效和生存,同时也增加了医疗费用。目前针对血小板减少症的治疗包括血小板输注和给予促血小板生长因子。促血小板生长因子包括重组人促血小板生成素(recombinant human thrombopoietin, rhTPO)、重组人白细胞介素-11(recombinant human interleukin-11, rhIL-11)和促血小板生成素受体激动剂(Thrombopoietin receptor agonists)艾曲波帕(]Ehmmbopag)和罗米司汀(Romiplostim)。目前,仅rhTPO和rhIL-11被国家食品药品监督管理总局(China Food and Drug Administration, CFDA)批准用于治疗肿瘤相关的血小板减少症,二者均起效慢且价格昂贵。此外,反复的血小板输注易引起自身血小板抗体的产生,导致血小板输注无效。因此开发新的促血小板生长因子成为许多学者研究的工作重点。褪黑素(melatonin,MLT)化学名为5-甲氧基-N-乙酰色胺,是调节神经系统及内分泌系统的主要因子之一。既往临床研究证实MLT能够降低肿瘤患者血小板减少症的发生率,然而MLT对巨核细胞／血小板形成和存活的影响及作用机制尚未见报道。本课题组前期研究已证实5-羟色胺(serotonin,5-HT)能够刺激造血和巨核细胞生成。MLT是5-HT的乙酰化产物。因此,我们推测MLT可能会影响巨核细胞生成及血小板形成,因此,对血小板减少症具有治疗作用。本研究目的通过动物实验和细胞实验验证上述假说。研究内容与研究方法1.血小板减少症小鼠模型的建立及体内实验观察指标取6-8周龄的雄性Balb/c小鼠24只,随机分为正常对照组(Normal组),模型对照组(Control组,生理盐水腹腔注射),MLT组(melatonin, 10mg/kg/d),TPO组(TPO, 1μg/kg/d),每组6只：除正常对照组外,剩余三组小鼠均给予4Gy全身放射线照射3分钟。照射后,连续21天按照分组分别通过腹腔注射给予相应的因子。观察第0、7、14、21天各组小鼠外周血红细胞、白细胞、血小板计数水平；21天后,处死各组小鼠取胸骨制作病理切片(5μm厚度),瑞氏吉姆萨染色和HE染色法观察骨髓组织病理学改变；测量各组小鼠第0、7、14、21天体重；21天时,测量肝、肾及脾脏重量；21天后,将小鼠处死,取双侧股骨分离提取小鼠骨髓细胞,采用甲基纤维素法培养分析粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(colony forming units-granulocyte macrophage, CFU-GM)、红细胞集落形成单位(burst-forming units-erythroid/colony forming units-erythroid, BFU/CFU-E)及粒细胞、红细胞、单核细胞及巨核细胞集落形成单位(colony forming units-granulocyte,erythrocyte,monocyte and megakaryocyte, CFU-GEMM)的形成能力；血浆凝块法培养巨核细胞集落(colony forming units-megakaryocyte, CFU-MK);贴壁法培养成纤维细胞集落(colony froming units-fibroblast, CFU-F)。2. CHRF-288-11(CHRF)细胞的生物学特性采用瑞氏吉姆萨染色法检测CHRF细胞的形态学特征；应用细胞计数法绘制CHRF细胞生长曲线,并计算对数生长期细胞的群体倍增时间；采用流式细胞术检测分析CHRF细胞的表面分子标记表达；G显带法分析CHRF的染色体核型。3.MLT对CHRF细胞的增殖和凋亡的影响CCK-8法、细胞计数法分别检测不同浓度MLT(0,20,50,100,200,500nM)对CHRF存活率的影响；去血清饥饿培养法诱导细胞凋亡,而后加入MLT或TPO,37℃,5%CO2完全湿度培养箱内培养72小时,收集各处理组细胞,流式细胞术检测Annexin V/PI, Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide (JC-1), Caspase-3等凋亡相关蛋白或分子表达水平变化。4.检测CHRF细胞表面MLT受体表达采用荧光定量PCR和Western Blotting检测CHRF细胞表面MLT受体(MTl和MT2)的表达水平。5.MLT影响巨核系细胞生成的分子机制利用Western Blotting检测MLT对PI3K/Akt信号转导通路磷酸化蛋白表达水平的影响及MLT受体在该过程中的作用。6.统计学分析实验数据分析采用SPSS13.0统计学软件,对于连续型变量,首先进行正态性分布检验,对于符合正态性分布的数据采用均数±标准差表示,两组单独计量资料的比较采用独立样本t检验,多组之间的比较采用完全随机设计单因素的方差分析(one-way ANOVA),方差齐时整体的比较采用F检验,多重比较采用Bonferroni法,方差不齐时采用Welch近似F检验,多重比较采用Dunnett’s T3法；当P<0.05时认为差异具有统计学意义。研究结果1、MLT对放射性骨髓抑制小鼠模型骨髓造血恢复的影响(1)小鼠外周血血细胞计数①红细胞计数放射后Control组、MLT组和TPO组红细胞计数均出现下降,第7天时最低,随后逐渐恢复；第7天时,各组间比较差异具有统计学意义(F=4.212,P=0.035),两两比较发现仅TPO组与Control组差异具有统计学意义[(7.950±0.596)×1012/L versus(6.717±0.512)×1012/L,n=6,P=0.043]；第14天与第7天时的结果相似,三组间比较的差异具有统计学意义(F=5.349,P=0.018),两两比较MLT组与Control组无统计学差异(P=0.080),而TPO组显著优于Control组[(9.350±0.880)×1012/L versus(8.067±0.476)×1012/L,n=6,P=0.022]；第21天时,三组比较之间差异具有统计学意义(F=14.998,P=0.000),两两比较MLT组、TPO组均显著高于Control组[MLT组versus Control组：(10.400±0.894)×1012/Lversus(8.800±0.469)×1012/L,n=6,P=0.004；TPO组versus Contol组：(10.917±0.665)×1012/L versus(8.800±0.469)×1012/L, n=6,P=0.000].上述结果表明：MLT能够促进放射性骨髓抑制小鼠外周血红细胞计数的恢复。②白细胞计数给予全身放射后,小鼠白细胞计数逐渐降低,第7天时最低,然后逐渐恢复；第7、14天三组间白细胞计数比较均无统计学差异(第7天：F=3.369,P=0.062；第14天：F=2.830,P=0.091)；第21天时,各组间比较差异具有统计学意义(F=7.290,P=0.006),两两比较MLT组、TPO组白细胞计数均显著高于Contol组,差异具有统计学意义[MLT组versus Control组：(7.250±1.725)×109/Lversus(4.750±0.758)×109/L,n=6,P=0.040；TPO组versus Control组：(8.000±1.897)×109/L versus(4.750±0.758)×109/L,n=6,P=0.007]；MLT组与TPO组比较两组差异无统计学意义。上述结果表明：MLT能够促进外周血白细胞计数恢复,且与TPO作用相当。③血小板计数与红细胞、白细胞计数变化相似,放射后小鼠外周血血小板计数出现下降,第7天达到最低,之后又渐渐恢复；第0、7天三组间血小板计数值比较差异无统计学意义(第0天：F=0.638,P=0.542；第7天：F=1.353,P=0.288)；第14天时,三组间比较差异具有统计学意义(F=7.820,P=0.005),两两比较仅TPO组显著优于Control组[(385.000±55.045)×109/L versus(261.667±53.541)×109/L,n=6,P=0.004],而MLT组与Control组比较差异无统计学意义(P=0.200)；第21天时,各组外周血血小板计数比较差异具有统计学意义(F=8.005,P=0.004),MLT组、TPO组均显著高于Control组[MLT组versus Control组：(509.167±108.509)×109/L versus(336.667±84.951)×109/L,n=6,P=0.013；TPO组versus Control组：(520.000±69.282)×109/L versus(336.667±84.951)×109/L,n=6,P=0.008],但MLT组与TPO组差异不具有统计学意义。MLT具有与TPO相似的促进放射性小鼠外周血血小板计数恢复的作用。(2)、小鼠体重及脏器重量变化①小鼠体重称量与外周血计数变化趋势相同,放射后小鼠的体重逐渐下降,第7天时,四组(Normal组、Control组、MLT组与TPO组)之间比较小鼠体重差异具有统计学意义(F=5.532,P=0.006)；第14天时,各组小鼠体重均较前有所增加,但MLT组小鼠体重仍显著低于Normal组,差异具有统计学意义[(26.267±0.739)gversus(27.833±0.427)g,n.6,P=0.001]；第21天时,四组小鼠体重比较差异具有统计学意义(F=3.507,P=0.034),采用LSD法比较,MLT组小鼠体重依然显著低于Normal组[MLT组versus Normal组：(26.850±0.907)g versus(28.000± 0.735)g,n=6,LSD法比较P=0.018,但采用Bonferroni法,比较差异无统计学意义P=0.111]。②各组小鼠肝、肾、脾脏称重放射后第21天时,处死各组小鼠后,分别取其肝、肾、脾脏进行计重比较。肝脏重量,四组比较差异具有统计学意义(F=11.003,P=0.000),两两比较结果显示：MLT组显著低于Control组[(1.260±0.044)g versus(1.450±0.092)g,n=6, P=0.000]:肾脏计重组间比较差异具有统计学意义(F=7.552, P=0.001),两两比较发现：与Control组比较,LSD法分析显示仅TPO组与Control组比较差异具有统计学意义(n=6,P=0.011),而Bonferroni法提示无统计学意义(P=0.068)；与MLT组比较,Bonferroni法分析结果提示MLT组小鼠肾脏重量显著低于TPO组[(0.449±0.025)g versus(0.490±0.016)g,n=6,P=0.001],差异具有统计学意义：四组小鼠脾脏计重比较具有统计学意义(F=3.128,P=0.049),采用LSD法两两比较发现TPO组显著高于MLT组.Normal组小鼠脾脏重量[TPO组versus MLT组：(0.142±0.027)g versus(0.109±0.011)g,n=6,P=0.012；TPO组versus Normal组：(0.142±0.027)versus(0.113±0.018)g,n=6,P=0.025].不同的分析方法结果有差异,LSD法比较敏感,但Bonferroni法较保守,检验更为严格。上述结果提示：MLT对小鼠各脏器无显著保护作用。(3)MLT对骨髓集落形成的影响采用血浆凝块法进行CFU-MK的分析,MLT能够显著促进CFU-MK的形成[MLT组versus Control组：(33.000±0.018)versus(16.170±2.714),n=6,P<0.001]；其他集落(包括CFU-GM,BFU/CFU-E,及CFU-GEMM)采用甲基纤维素法进行培养分析；与Control组相比,MLT能够显著促进CFU-GM[(58.330±6.743) versus(41.170±4.834),n=6,P<0.01].BFU-E[(31.330±7.840)versus(12.000± 4.243),n=6,P<0.001]和CFU-GEMM[(20.830±2.041)versus(10.000±1.897),n=6,P<0.001]的形成,表明MLT能够促进粒系、红系造血恢复；CFU.F使用贴壁培养方法分析,MLT处理组与TPO处理组相比,CFU.F数量差异无统计学意义,提示MLT对骨髓间充质细胞的保护作用与TPO相当,二者均显著优于对照组[MLT组versus Control组(21.670±2.422)versus(11.670±3.502),n=6,P<0.001；TPO组versus Control组(20.830±6.513)versus(11.670±3.502),n=6,P <0.001]。(4)骨髓组织病理学检测21天后,将各组小鼠全部处死后进行骨髓组织学分析,对照组小鼠骨髓组织造血细胞数较正常小鼠明显减少,坏死与凋亡细胞比例高于正常小鼠；MLT,TPO处理组小鼠骨髓组织细胞数多于对照组,特别是巨核系细胞,在MLT组骨髓组织中巨核细胞及其祖细胞数均显著多于对照组；TPO处理组,巨核细胞及其祖细胞恢复的较粒系及红系更好。2.CHRF-288-11细胞的生物学特征瑞氏吉姆萨染色,CHRF细胞胞体较大,胞核大,形态不规则,染色胞质不均匀,染色深蓝色,符合巨核细胞形态特征；流式细胞术分析细胞表面分子标记,CHRF细胞高表达CD61:92.07%,CD41:99.04%,CD42:95.03%巨核系特异性分子标记,高表达CD13:99.20%,CD33:98.11%；HLA-DR:25.010%,表达阳性；CD3:6.310%,CD34:2.540%,CDl9:5.5%,CD38:2.760%,表达为阴性。CHRF染色体核型95,XY,存在多条染色体数目异常；CHRF细胞对数生长期群体倍增时间为58.88小时。3、MLT对CHRF细胞增殖和凋亡的影响(1)MLT能够促进巨核细胞增殖并具有时间与浓度依赖性,200nnM时促进作用最强。(2)MLT对CHRF凋亡的影响①Annexin V/PI早期凋亡细胞比例四组比较差异无统计学意义(F=1.714,P=0.217)；但晚期凋亡细胞比例四组之间存在显著统计学差异(F=23.087,P=0.000)；多组比较结果表明：MLT、TPO组晚期凋亡细胞均较对照组降低,Bonferroni法分析差异具有统计学意义[MLT组versus Control组：(13.143±2.510)%versus(26.105± 4.638)%,n=4,P<0.01；TPO组versus Control组(10.620±3.145)%versus (26.105±4.638)%,n=4,P<0.001]；总凋亡率四组比较差异具有统计学意义(F=25.860,P=0.000)；细胞总凋亡率比较,MLT.TPO组显著低于对照组[MLT组versus Control组：(14.180±2.492)%versus(27.930±3.828)%,n=4,P<0.001；TPO组versus Control组(11.960±3.661)%versus(27.930±3.828)%,n=4,P<0.001],差异具有统计学意义。②Caspase-3和JC-1检测Caspase-3活化率比较差异具有统计学意义(F=107.428,P=0.000)；MLT组Caspase-3的活化水平较对照组降低,且差异具有统计学意义[(22.833±2.275)%versus(31.200±2.022)%,n=3,P=0.002]；MLT组与TPO组比较差异无统计学意义[(22.833±2.275)%versus(19.900±1.179)%,n=3,P=0.252].JC-1检测结果与Caspase-3检测结果相似,对照组细胞JC-1阳性细胞比例明显增高。MLT组与对照组比较差异具有统计学意义[(36.553±2.259)％versus (44.503±3.033)％,n=3,P=0.048],而与TPO组比较差异无统计学意义[(36.553±2.259)％versus(34.873±2.671)％,n=3,P>0.05].4、MLT受体在CHRF表达情况(1)荧光定量PCR检测MLT受体mRNA水平表达采用两独立样本t检验分析,MT1 mRNA在CHRF细胞和L-02肝细胞中相对表达量分别为：0.000±0.000,0.824±0.543,Levene方差齐性检验F=6.550,P=0.034,方差不齐,t=--3.390, P=0.028,MT1 mRNA在CHRF细胞表达水平显著低于L-02细胞。MT2 mRNA在CHRF细胞和L-02肝细胞中相对表达量分别为：0.216±0.111,0.583±0.302,Levene方差齐性检验F=3.206,P=0.124；两组比较t=-2.282,P=0.063,因此,MT2 mRNA在CHRF和L-02两种细胞表达水平比较差异无统计学意义。(2)Western-Blotting检测MLT受体蛋白水平表达检测结果与RT-PCR结果一致,CHRF细胞表达MT2受体。5、MLT对P13K/Akt信号通路的影响(1)MLT对Akt蛋白表达的影响MLT处理后,p-Akt水平较对照组显著升高,差异具有统计学意义[MLT组versus Control组(69.370±6.787)％versus(33.479±6.056)％,n=5,P=0.000]；MLT联合PI3K抑制剂Wortmannin (100nM)处理组,p-AKt水平较MLT单独处理组显著降低,差异具有统计学意义[(MLT+Wortmannin)组versus Melatonin组：(42.700±13.645)％versus(69.370±6.787)％,n=5,P=0.002].Wortmannin单独处理组p-Akt表达水平显著低于MLT组[Wortmannin组versus Melatonin组：(25.767±7.734)％versus(69.370±6.787)％,n=5,P=0.000],而与Control组、(MLT+Wortmannin)组比较均无统计学差异(P>0.05)。(2)MLT受体阻滞剂Luzindole对MLT活化p-Akt的影响首先对各组比较结果进行Levene检验,方差不齐,F=5.987,P=0.006；组间比较采用近似的Welch检验,P=0.000；采用Dunnett’s T3方法进行两两多重比较；结果提示：MLT处理后,p-Akt水平较对照组显著升高,差异具有统计学意义[MLT组versus Control组：(51.988±10.090)%versus(14.277±6.513)%,n= 5,P=0.001]；MLT联合MLT受体阻滞剂Luzindole(1μM)处理组,p-Akt水平较MLT单独处理组显著降低,差异具有统计学意义[(MET+Luzindole)组versusMLT组：(3.436±1.113)%versus(51.988±10.090)%,n=5,P,=0.002]；而与对照组相比差异无统计学意义[(MLT+Luzindole)组versus Control组：(3.436±1.113)%versus(14.277±6.513)％,n=5,P=0.081]。Lnzindole单独处理组p-Akt表达水平较MLT组显著降低[Luzindole组versus MLT组:(10.084±4.779)%versus(51.988 ±10.090)%,n=5,P=0.001],而与Contol组,(MLT+Luzindole)组比较均无统计学差异[Luzidole组versus Contol组：P=0.804；Luzindole组versus(MET+ Luzindole)组：P=0.139]。研究结论1、MLT能够促进放射性血小板减少症小鼠模型的造血恢复。2.CHRF符合巨核细胞的形态学特征,并高表达CD41、CD61、CD42等特异性巨核细胞系表面分子标记。3、MLT能够促进巨核细胞增殖,减少细胞凋亡,具有抗凋亡作用。MLT对巨核细胞的抗凋亡作用是通过降低线粒体膜的渗透量和减少活化的Caspase-3的表达来实现的。4.CHRF细胞表达MT2受体。5、MLT可能通过MT2受体激活P13K,Akt信号转导通路发挥抗凋亡作用。