轮状病毒腹泻是引起新生儿死亡的主要原因之一,尽管目前已经在世界范围内使用抗病毒疫苗降低了死亡率,但是感染初期引起的腹泻仍会导致严重脱水,造成发育迟缓,甚至导致死亡。抗腹泻药物能够抑制脱水、延长救治时间,是比较理想的治疗手段。目前认为霍乱弧菌和致病大肠杆菌内毒素能够通过提高c AMP和c GMP水平激活CFTR氯离子通道,引起Cl^-大量分泌并带动水和Na+的转运;而轮状病毒引起腹泻的机制可能是通过激活肠道上皮Ca²⁺激活氯离子通道（Ca CC）引起肠道液体大量分泌,或者激活肠壁Cajal细胞TMEM16A型Ca CC引起肠道平滑肌强收缩导致腹泻,但对于其确切的发病机理还存在争议。通过使用选择性Ca CC抑制剂阻断通道开放有助于阐明不同Ca CC在轮状病毒腹泻中的作用。Ca CC抑制剂也可以作为抗腹泻药物,治疗轮状病毒和其他激活Ca CC因素导致的腹泻。选择性Ca CC抑制剂是研究Ca CC功能最重要的药理学工具,现有Ca CC抑制剂由于亲和力低、选择性差等原因使其应用受到限制,因此寻找高亲和力、高选择性的Ca CC抑制剂仍是该领域亟待解决的问题。在本研究中我们利用稳定转染卤族元素敏感的YFP荧光蛋白的结肠癌HT-29细胞（表达内源性Ca CC）和FRT-TMEM16A大鼠甲状腺上皮细胞作为筛选模型,对中草药来源的天然小分子库及组分库进行筛选,发现了白藜芦醇二聚体（trans-ε-viniferin,TV）和白藜芦醇四聚体（r-2-viniferin,RV）及拳参组分D5具有显著的Ca CC抑制活性。TV和RV能够以剂量依赖的方式抑制由ATP和卡巴胆碱激活HT-29细胞Ca CC而产生的I-内流,IC50分别为1.1μM和12.3μM。拳参组分D5以剂量依赖的方式抑制FRT细胞上TMEM16A介导的I-内流,浓度为200μg/m L时能够完全抑制TMEM16A的活性,IC50约为32.2μg/m L。通过短路电流方法以及体内外活性测定法对TV、RV和拳参组分D5的分子药理学特性和抗腹泻作用进行系统分析。首先通过细胞短路电流实验对TV和RV抑制作用的量-效关系、作用位点、作用方式等进行分子药理学分析,结果显示:（1）TV和RV以剂量依赖的方式抑制HT-29细胞上由ATP激活的氯离子短路电流,浓度分别为5μM和50μM时达到完全抑制,IC50分别约为1μM和20μM;（2）TV和RV主要在细胞顶膜侧发挥Ca CC抑制活性,而在基底膜侧无抑制活性;（3）5μM TV能够完全阻断HT-29细胞由ATP引起的持续Cl^-电流,但对ATP引起的瞬时Cl^-电流抑制作用微弱;50μM RV不仅完全阻断ATP引起的持续Cl^-电流,对ATP引起的瞬时Cl^-电流也有显著抑制作用。TMEM16A小分子抑制剂T16Ainh-A01仅能抑制10%的持续电流;（4）TV在5μM时对基础状态Ca²⁺浓度和由ATP刺激产生的细胞内Ca²⁺浓度升高没有明显的影响,而RV在50μM时产生微弱的抑制活性（抑制率约为17.4%）。目前已知身份的肠上皮细胞Cl^-通道包括CFTR和TMEM16A,选择性抑制作用分析显示:（1）TV和RV在FRT细胞顶膜侧分别为200μM和50μM时完全抑制Eact激活的TMEM16A Cl^-电流,IC50分别为50μM和10μM。200μg/m L拳参组分D5在顶膜侧完全抑制Eact激活的氯离子电流;（2）TV和RV以剂量依赖方式抑制HT-29细胞上由forskolin激活的CFTR Cl^-电流,IC50分别为3μM和80μM。通过离体组织短路电流实验,在小鼠结肠组织上对于TV和RV的Ca CC抑制活性进行的分析显示:（1）TV和RV在粘膜侧能够以剂量依赖方式抑制小鼠的结肠粘膜由卡巴胆碱引起的短路电流,最大抑制率为57%和47%,剩余部分电流被CFTR抑制剂BPO-27和K+通道抑制剂克霉唑完全抑制;（2）拳参D5组分在粘膜侧能够抑制由卡巴胆碱激活的短路电流,最大抑制率约为50%,而在浆膜侧没有明显的抑制活性;（3）抗腹泻药crofelemer（1 m M）对小鼠结肠由forskolin引起的CFTR Cl^-电流没有抑制作用,但能完全抑制卡巴胆碱激活的Ca CC Cl^-电流。除了肠道Cl^-分泌之外,肠动力的改变也间接影响肠道液体净分泌量,因此通过小鼠肠收缩及肠蠕动实验对TV和RV的肠动力调节作用进行研究,结果发现:（1）TV在5-200μM范围内,RV在10-100μM范围内以剂量依赖的方式抑制回肠平滑肌收缩,有效作用浓度与TV和RV对TMEM16A的抑制浓度相符;（2）小鼠经灌胃,分别给予1 m M TV和RV均能有效减缓肠蠕动速度,拳参组分D5通过腹腔注射和灌胃给药均能抑制肠蠕动。目前认为轮状病毒是以一种非结构蛋白NSP4及其活性片段作为病毒分泌的内毒素激活肠道Ca CC而引起腹泻的,并且轮状病毒腹泻主要发生在婴幼儿时期。因此我们利用新生小鼠建立轮状病毒腹泻模型,通过测定粪便含水量对Ca CC抑制剂TV和RV的抗腹泻作用进行了评价。结果显示TV和RV通过不同给药方式均能够抑制新生小鼠感染病毒后出现的水样腹泻,有效作用浓度低于Ca CCinh-A01。病理切片结果显示,小鼠接种病毒第三天肠细胞出现大液泡,肠绒毛顶端出现肿胀,TV治疗组回肠组织切片中也出现了类似的液泡化,而正常小鼠并没有出现上述现象。肠吸收实验结果显示,与对照组相比,TV在30 min内没有改变空肠管内的液体吸收情况。色谱分析显示拳参组分D5的TMEM16A抑制活性与化合物ECG、EGCG、TV和RV无关。综上所述,TV、RV和拳参组分D5都具有Ca CC抑制活性,其中TV是迄今发现的亲和力最高的上皮型Ca CC抑制剂。通过细胞短路电流实验证明了TV和RV的作用部位在肠上皮细胞顶膜侧,并证实了肠道上皮存在非TMEM16A型Ca²⁺激活氯离子通道Ca CCGI(Castrointestinal epithelial Ca²⁺-activated chloride channel),Ca CCGI是肠道上皮介导液体分泌的主要Ca²⁺激活氯离子通道。离体组织短路电流实验结果证明了TV、RV和拳参组分D5均能抑制结肠粘膜由卡巴胆碱激活的Ca CCGI,而CFTR和K+通道也参与卡巴胆碱诱导产生的电流。Crofelemer在组织水平的活性,主要是抑制肠道Ca CCGI而不是抑制CFTR。化合物TV、RV以及拳参组分D5在高浓度条件下,通过抑制TMEM16A来抑制肠收缩,减缓肠道蠕动。TV和RV能够有效抑制轮状病毒引起的小鼠腹泻,而不影响病毒感染和肠道液体吸收,证明了轮状病毒腹泻是一种通过激活Ca CCGI增加液体的净分泌量而引起的腹泻。本研究对阐明腹泻条件下Ca CCGI和TMEM16A氯离子通道在肠道液体分泌和肠道动力中的作用具有重要的理论意义,明确了Ca CCGI和TMEM16A作为抗腹泻治疗新靶点的有效性。此外,本研究还为以氯离子通道为靶标,治疗分泌型腹泻,提供了新的治疗策略和先导化合物。