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奶牛乳房炎严重制约奶牛养殖业经济效益和乳业发展。因此,对病原菌的有效识别成为减少经济损失的关键途径之一。目前已有的研究表明引起奶牛乳房炎的病原菌主要是葡萄球菌、链球菌以及肠道细菌,其中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和链球菌占较大比例,其他病原微生物如革兰氏阳性杆菌、真菌等的感染也时有发生。本研究以大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和白色念珠菌（Canidia albicans）共七种奶牛乳房炎病原菌为对象,首先利用不同商业化试剂盒进行基因组DNA提取,从DNA提取质量、提取过程的复杂程度及性价比等方面,筛选最佳基因组DNA提取试剂盒;其次通过NCBI-Blast比较特异性选择大肠杆菌（E.coli）phoA基因、金黄色葡萄球菌（S.aureus）nuc基因、表皮葡萄球菌（S.epidermidis）gyrB基因、无乳链球菌（S.agalactiae）RDF1058标签、停乳链球菌（S.dysgalactiae）isp基因、蜡样芽孢杆菌（B.cereus）gyrB基因和白色念珠菌（C.albicans）18S rRNA基因序列作为检测菌种的目的基因,通过设计、筛选、合成各基因的特异性引物,并对PCR反应体系和条件进行优化,结果表明在20μL反应体系中最佳退火温度为56℃,上下游引物的添加量各0.5μL。引物特异性试验结果表明,本研究设计的引物特异性良好,无非特异性条带扩增,在同一PCR扩增条件下可利用多孔PCR扩增板同时检测七种病原菌,提高了检测速度。在此基础上测定了PCR检测方法的灵敏度,结果表明大肠杆菌（E.coli）的最低检测限为1.04×105cfu/ml、金黄色葡萄球菌（S.aureus）为1.04×104cfu/ml、表皮葡萄球菌（S.epidermidis）为2.3×104cfu/ml、无乳链球菌（S.agalactiae）为9.4×103cfu/ml、停乳链球菌（S.dysgalactiae）为9×103cfu/ml、蜡样芽孢杆菌（B.cereus）为1.9×102cfu/ml以及白色念珠菌（C.albicans）的4.24×103cfu/ml。最后对临床奶样和人工模拟乳样进行检测,验证了敏感性和特异性,并对最低检测限度进行测试。结果表明,所建立PCR检测方法的特异性在88.24%-100%,敏感性为92.73%-98%,适合于奶牛养殖场快速检测。